芥子氣致小鼠耳廓皮膚損傷的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本文采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了芥子氣染毒皮膚蛋白表達(dá)譜的變化情況，并找到一些差異表達(dá)的關(guān)鍵蛋白，從整體水平對(duì)芥子氣皮膚損傷的分子機(jī)制有了進(jìn)一步的了解和認(rèn)識(shí)，并為從分子水平探索出相應(yīng)的拮抗措施奠定了基礎(chǔ)，具體工作如下： 1．芥子氣誘導(dǎo)小鼠耳廓皮膚差異蛋白的鑒定。 通過(guò)芥子氣染毒后小鼠耳廓皮膚蛋白質(zhì)組的改變，探索了芥子氣皮膚損傷的分子機(jī)制。5μL(160g·L-1)芥子氣經(jīng)小鼠耳廓內(nèi)側(cè)皮膚染毒，于染毒后6h和24h制備蛋白樣品

2、，采用雙向電泳技術(shù)分離蛋白樣品，ImageMaster5．01軟件處理雙向電泳圖譜，MALDI-TOF-MS分析差異蛋白點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋譜。正常對(duì)照組、染毒后6h組、染毒后24h組分別檢測(cè)到1442、1451、1158個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，各組蛋白質(zhì)的匹配百分比為64．5％～82．0％。共計(jì)鑒定了15個(gè)差異蛋白，小鼠耳廓染毒后表達(dá)上升的蛋白有：載脂蛋白A-I和前白蛋白；表達(dá)下降的蛋白有：過(guò)氧化物氧還酶6、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、羰基還原酶3、

3、肌動(dòng)蛋白、谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶Mu2和A3,5，△2.4-二烯酰輔酶A異構(gòu)酶；6h時(shí)表達(dá)卜升，24h時(shí)下降的蛋白有：丙糖磷酸異構(gòu)酶、脂肪酸結(jié)合蛋白、微絲結(jié)合蛋白一1、肌動(dòng)蛋白解聚因子和蛋白突觸結(jié)合蛋白樣蛋白一3的剪接同工型4；6h時(shí)表達(dá)下降，24h時(shí)．卜升的蛋白是半胱氨酸蛋白酶抑制劑B。鈣粒蛋白B僅出現(xiàn)于染毒后6h組，對(duì)照組與24h染毒組均未出現(xiàn)。結(jié)果表明，芥子氣染毒能誘導(dǎo)小鼠皮膚蛋白表達(dá)譜的改變，差異蛋白主要與過(guò)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及能量

4、代謝等相關(guān)，提示蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種有效的揭示芥子氣皮膚損傷機(jī)制的手段，并進(jìn)一步反映出芥子氣具有多水平、多靶點(diǎn)的作用特性。 2．差異蛋白．GSTMu2活性、表達(dá)水平確證及其與芥子氣誘導(dǎo)小鼠表皮基底細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。 采用1氯-2,4-二硝基苯(CNDB)法測(cè)定了谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶的活性，本法基于GST具有催化還原型谷胱甘肽(GSH)與CNDB底物結(jié)合的能力，在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，其活性的高低與反應(yīng)前后底物濃度的變化呈線性關(guān)系

5、。結(jié)果顯示，5μL芥子氣(160g．L-1)染毒后，隨著時(shí)間的推移谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶的活性逐漸降低。采用Westernblot技術(shù)鑒定了芥子氣染毒后谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶Mu2的表達(dá)變化，結(jié)果表明，5μL芥子氣(160g．L-1)染毒后，隨著時(shí)間的推移，谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶Mu2的表達(dá)水平顯著降低。采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表皮基底細(xì)胞凋亡的鑒定。技術(shù)路線為：小鼠耳廓染毒后6h及24h，分離表皮角質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)AnnexinV-FITC／PI雙染色后，流