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文檔簡介
1、脊髓損傷(spinal cord injurey, SCI)這一嚴重致殘的重大傷病目前仍是世界性難題,其病理學基礎主要是直接或間接的損傷導致軸突變性和神經(jīng)元壞死。成人SCI后微環(huán)境的破壞致使中樞神經(jīng)再生困難。然而,由于SCI病理改變的復雜性,其治療效果一直欠佳,因此SCI及其修復機理是當今世界神經(jīng)科學關注的熱點之一。為了征服這一疾病,眾多神經(jīng)科學工作者致力于此研究領域,希望通過研究、能找到緩解SCI給病人及家庭和社會帶來危害的有效方法。
2、目前,諸多團隊在SCI修復的治療方法及機制研究方面做了大量工作,其中,神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)因其可以分化為神經(jīng)元與膠質細胞而倍受關注,而SCI后通過靜脈注射NSCs,可以在損傷灶發(fā)現(xiàn)移植的NSCs,并能分化為一定數(shù)量的神經(jīng)元跟膠質細胞,使得NSCs被考慮可作為一種細胞替代療法的種子細胞進行治療應用研究,這也讓我們看到了讓SCI截癱病人恢復的希望。然而迄今為止,移植NSCs的有效性尚不理想,主要存在的問
3、題是,如果早期移植,容易因炎癥反應而被體內巨噬細胞吞噬;如果移植較晚,則損傷灶容易形成瘢痕組織,影響神經(jīng)元的修復。有研究表明,在SCI后第7天移植NSCs效果較好,可能與該時期可避免巨噬細胞的吞噬、疤痕組織也未開始充分形成有關。為了更好地探討如何提高NSCs移植療效,本研究以大鼠SCI后的NSCs移植治療為研究理念、以microRNA為骨髓基質細胞源神經(jīng)干細胞(BMSCs-D-NSCs)調控手段,進行了microRNA調節(jié)NSCs向神經(jīng)
4、元方向分化、治療大鼠SCI的實驗探討。
microRNA即小RNA,是一種存在于植物和動物基因組里的小分子RNA,約20~24nt(少數(shù)小于20nt),由一段具有發(fā)夾環(huán)結構、長度為70~80nt的單鏈RNA前體(Pre-miRNA)剪切后形成。它通過與其目標mRNA分子的3,端非編碼區(qū)域(3'-untranslated region,3'UTR)完全或非完全互補匹配、參與基因轉錄后水平(蛋白表達)的調控,在生物體內各種生理和病
5、理狀態(tài)都發(fā)揮著十分重要的作用。
miRNA最早由Lee等1993年在對線蟲(Caenothabditis elegans)胚胎發(fā)育研究過程中發(fā)現(xiàn)的一種具有調控功能的非編碼RNA。首先,miRNA基因的初級轉錄產物(Pri-miRNA)在細胞核中被RNaseⅢ Drosha切割成為前體miRNA(pre-miRNA)。在最初的剪切后,Pre-miRNA在轉運蛋白exPortin-5的作用下、由核內轉到胞質中,然后由另一種RNas
6、eⅢ Dicer進一步切割產生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與其他蛋白質一起組成RISC(RNA-inducedsileneing complex)復合體,從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。
microRNAs具有重要的組織特異功能,在基因表達中發(fā)揮著總體調控作用,其中miR-124是神經(jīng)系統(tǒng)特異表達且最富含的microRNA。在雞胚神經(jīng)節(jié),miR-124限制性地表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve sy
7、stem,CNS);在小鼠神經(jīng)中樞(大腦皮層,小腦和脊髓),miR-124濃集超過其它器官的100倍。但是,miR-124在CNS解剖區(qū)域上的表達存在明顯差異,在大腦皮層表達最多,小腦表達率是大腦皮層的60.7%,脊髓是35.4%。同時,miR-124在細胞增殖和分化過程的表達量也會發(fā)生變化。目前,對miR-124在CNS的表達研究更多局限在果蠅、小鼠和人類相關組織,而在大鼠等動物中的研究還較少,但大鼠一般又被用來進行SCI實驗研究更適
8、宜。miR-124調控神經(jīng)元的細胞周期、細胞分化、脊髓的發(fā)育等一系列重要生理活動,作為神經(jīng)系統(tǒng)特異的microRNA,對神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷的調控機制尚未明了,尤其對SCI中的相關治療(如NSCs移植治療等)調控作用尚缺少文獻報道。本課題將探討miR-124調節(jié)NSCs在大鼠SCI中的移植治療作用。
第一部分:miR-124對BMSCs-D-NSCs的促分化作用
目的:將慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-cop
9、GFP進行EcoRI/BamHI酶切,在基因庫中查詢miR-124序列5'-UAAGGCA CGCGGUGAAUGCC-3',并進行人工合成,利用PCR技術設計引物前鏈5'-GCCGATTC(EcoRI)CATCGCGTTCCCCAAA CCCC-3'與反義鏈引物5'-GCCGGATCC(BamHI)AGGGATGAAGGTG CTGGCCT,再用PCR擴增microRNA Rno-miR-124,并在上游和下游引物分別添加限制性酶切位
10、點EcoRI和BamHI,將以上兩部分酶切連接后轉化到DH5-a內。挑取陽性克隆,用PCR測序鑒定。構建質粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-mo-miR-124(其中GFP為報告基因),并轉染293T細胞。收取病毒上清液感染骨髓基質細胞(bone marrow stroma cells,BMSCs),并利用RT-PCR測定miR-124轉染BMSCs后及誘導成NSCs后的表達情況、進一步觀察BMSCs-D-NSCs分化為
11、神經(jīng)元與膠質細胞的情況。
統(tǒng)計學處理:所有數(shù)據(jù)均采用Mean±SD表示,Indepent samples t-test用來比較轉染組與未轉染組NSCs分化為神經(jīng)元與膠質細胞的情況。統(tǒng)計學軟件采用SPSS17.0,P<0.05為有顯著統(tǒng)計學意義。
結果:BMSCs的轉染率可達90%以上,RT-PCR結果表明,轉染后BMSCs的miR-124表達量為轉染前的30-fold;經(jīng)過誘導成NSCs(BMSCs-D-NSCs)后
12、,轉染組NeuN陽性細胞的比例為53.60%±3.31%,未轉染組比例為34.40%±2.88%(p<0.001);轉染組GFAP陽性細胞的比例為42.20%±1.62%,未轉染組為51.90%±3.03%(p<0.001)。
結論:miR-124在體外可以促進NSCs向神經(jīng)元分化。
第二部分:miR-124調節(jié)BMSCs-D-NSCs對SCI治療作用
目的:將攜帶miR-124的BMSCs經(jīng)鼠尾靜脈注射,
13、治療SCI,觀察miR-124-BMSCs-D-NSCs治療效果。
方法:根據(jù)改良Allen's方法制作動物模型。取90只成年Wistar大鼠、以氯胺酮(500mg/kg)腹腔注射麻醉,俯臥固定,以T10為中心縱行切口,顯露脊髓大小為3.0cm×0.4 cm的打擊區(qū)。以重20g、打擊頭直徑3mm的打擊器自10 cm高度自由落下,打擊勢能為2009.cm,打擊1次。次日見大鼠雙后肢完全松弛視為SCI建模成功。依實驗條件將SCI模
14、型分為3組:第一組為術后未治療組,注射生理鹽水;第二組為正常移植組,注射BMSCs-D-NSCs;第三組為轉染移植組,注射miR-124-BMSCs-D-NSCs。取三組第1天,1周,2周及4周SCI的標本,進行HE染色,比較正常移植組與轉染移植組相對于損傷后未治療對照組空洞的變化。大鼠脊髓功能的恢復依據(jù)BBB評分標準進行判斷。
統(tǒng)計學處理:所有數(shù)據(jù)均采用Mean±SD表示,Independent samples t-test
15、用以比較轉染組、未轉染組與正常對照組之間的脊髓空洞變化。利用ANOVA中的LSD法,比較三組間BBB的差異。統(tǒng)計學軟件采用SPSS17.0,P<0.05為有顯著統(tǒng)計學意義。
結果:移植后14天,通過免疫熒光組織化學檢測法、對體內移植細胞鑒定分析,發(fā)現(xiàn)病變部位有較明顯的miR-124-BMSCs-D-NSCs聚集(miR-124-BMSCs-D-NSCs由GFP所標記),主要在受損脊髓的周邊(圖11A)。此外,共聚焦圖像顯示,有
16、較多表達神經(jīng)元標記物神經(jīng)元核蛋白(neuronnucleoprotein,NeuN)陽性的細胞(圖11B)和較少表達星形膠質細胞標記物膠質纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的細胞(圖11C)出現(xiàn)在移植后14天。NeuN染色陽性細胞存活比率占16.0%±1.3%(Mean±SD),GFAP陽性細胞的成活率為13.95%±1.2%(Mean±SD)。損傷灶的大小在SCI后第28天,利用切
17、片進行顯微測量計算。miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組與對照組相比,減少的脊髓組織損傷范圍、與單純NSCs移植組相對于對照組減少的脊髓組織損傷范圍,均有統(tǒng)計學差異(P<0.001),BMSCs-D-NSCs組相對于正常對照組、減小的體積為3.3%,轉染組相對于正常對照組、減少的體積為6.4%。
BBB評分
對以下三組動物進行BBB評分:未治療對照組(注射生理鹽水),單純NSCs移植組與miR-124-BM
18、SCs-D-NSCs移植組。每一周每組5只大鼠,觀察1~6周(n=90),比較每一周內三組之間BBB評分的關系。第1周,三組之間BBB評分無顯著統(tǒng)計學差異(P=0.804)。第2周,單純BMSCs-D-NSCs移植組與損傷后未治療對照組BBB評分有顯著統(tǒng)計學差異(9.20±0.84 vs.7.8±0.84,P=0.017),損傷后未治療對照組與miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組之間的BBB評分有顯著統(tǒng)計學差異(7.8±0.8
19、4 vs.9.20±0.71,P=0.035),單純BMSCs-D-NSCs移植組與miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組之間無明顯統(tǒng)計學差異(9.20±0.84 vs.9.20±0.71,P=0.698)。第3周,單純BMSCs-D-NSCs移植組與損傷后未治療對照組有顯著統(tǒng)計學差異(10.60±1.14 vs.8.80±0.45,P=0.006),miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組與損傷后未治療對照組亦有顯著統(tǒng)計
20、學差異(11.20±0.84 vs.8.80±0.45,P=0.001),但是單純BMSCs-D-NSCs組與miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組無明顯統(tǒng)計學差異(10.60±1.14 vs.11.20±0.84,P=0.290)。第4周,單純BMSCs-D-NSCs移植組與損傷后未治療對照組有顯著統(tǒng)計學差異(11.40±1.14 vs.9.80±0.48,P=0.007),miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組與單純
21、BMSCs-D-NSCs移植組之間有顯著統(tǒng)計學差異(13.40±0.55 vs.11.40±1.14,P=0.002),miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組與損傷后未治療對照組之間也有明顯統(tǒng)計學差異(13.40±0.55 vs.9.80±0.48,P<0.001)。第5周,三組之間兩兩比較均有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.001)。第6周,三組之間的兩兩比較亦均有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.001)(表2)。
結論:經(jīng)miR-
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