骨髓間充質(zhì)干細胞體外聯(lián)合嗅粘膜來源神經(jīng)干細胞移植治療大鼠脊髓損傷.pdf

1、脊髓損傷作為臨床常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，可導(dǎo)致?lián)p傷平面以下部分或完全的運動、感覺和自主神經(jīng)功能障礙等嚴重后果。時至今日，通過復(fù)雜的治療和強化的功能訓練雖可帶來少許的恢復(fù)，但治療過程緩慢，效果有限，并對較嚴重的脊髓損傷作用十分有限。目前針對較嚴重的脊髓損傷來說臨床上尚無可獲得顯著功能恢復(fù)的治療手段。干細胞療法可在實現(xiàn)結(jié)構(gòu)修復(fù)的同時對功能恢復(fù)有所助益，目前作為脊髓損傷治療的一個潛在手段被廣泛關(guān)注。本研究將聯(lián)合使用骨髓間充質(zhì)干細胞和嗅粘膜來源神

2、經(jīng)干細胞進行脊髓損傷模型的聯(lián)合移植治療。試圖使兩種細胞優(yōu)勢互補，增強其治療能力。其理論依據(jù)在于:由于骨髓間充質(zhì)干細胞在脊髓損傷的急性期可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，而神經(jīng)干細胞可以促進神經(jīng)元的修復(fù)和軸突的重新長出。
　　第一部分:嗅粘膜來源神經(jīng)干細胞和骨髓間充干細胞的提取和鑒定
　　目的:
　　使用水平振蕩法提取大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞并對其純度和分化能力進行鑒定;提取大鼠嗅粘膜來源的神經(jīng)干細胞，并對其進行鑒定。
　　方法:

3、r>　　無菌條件下從股骨和脛骨中抽出骨髓腔內(nèi)的骨髓，反復(fù)吹打?qū)⒐撬杌|(zhì)制成細胞懸液，離心后貼壁培養(yǎng)。將原代骨髓基質(zhì)細胞放入恒溫搖床內(nèi)進行搖動4小時，棄上清后傳代培養(yǎng)。使用流式細胞儀對獲得的BMSCs的純度進行鑒定，成骨成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)證明其分化能力。無菌條件下剝離大鼠嗅粘膜組織，從中提取神經(jīng)干細胞，培養(yǎng)后取神經(jīng)球消化傳代。使用免疫組化染色對所取細胞進行鑒定。
　　結(jié)果:
　　所獲得的BMSCs，CD29和CD90的陽性細胞比例分

4、別為99.1％和9.19％，而表達CD31和CD45的陽性細胞比率分別為0％和1.3％。經(jīng)過成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可向成骨細胞和脂肪細胞分化，產(chǎn)生鈣鹽結(jié)節(jié)和脂滴。從嗅粘膜提取的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)時可呈典型的神經(jīng)球，使用免疫熒光染色顯示P75、S100、Nestin、GFAP抗體陽性。
　　結(jié)論:
　　水平振蕩法可高效穩(wěn)定地獲得大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，減少傳代培養(yǎng)次數(shù)，細胞純度較高，具有分化潛能。從嗅粘膜提取的神經(jīng)干細胞具有培養(yǎng)過程

5、中具有神經(jīng)球的典型特征，神經(jīng)干指標鑒定陽性。
　　第二部分:大鼠嗅粘膜來源神經(jīng)干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)
　　目的:
　　分析大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞和嗅粘膜來源神經(jīng)干細胞體外直接共培養(yǎng)后分泌神經(jīng)相關(guān)營養(yǎng)因子的情況及對神經(jīng)元抗凋亡能力的影響。了解大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞和嗅粘膜來源神經(jīng)干細胞體外間接共培養(yǎng)后的相互作用情況。
　　方法:
　　將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞和嗅粘膜來源神經(jīng)干細胞體外直接共培養(yǎng)后，測定其上清

6、液中神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)和神經(jīng)生長因子(NGF)的含量，并與單一細胞上清液進行比較。將BMSCs和ONSCs進行非接觸共培養(yǎng)，使用熒光定量PCR測定共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)條件下，兩種細胞mRNA中Nestin、MAP-2、GFAP、Tuj1、NSF-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13表達含量。提取胎鼠神經(jīng)元細胞，使用炎癥因子(IL-1β)對神經(jīng)元進行刺激后，將神經(jīng)元分別與BMSCs、OM-NSCs以及BMSCs混合OM-NSCs

7、進行非接觸共培養(yǎng)，使用TUNNEL和MAP-2免疫熒光染色測定神經(jīng)元的凋亡率。
　　結(jié)果:
　　單獨培養(yǎng)時，BMSCs培養(yǎng)上清液中含NGF最多含NT-3最少，而OM-NSCs中含NT-3最多而NGF最少，直接共培養(yǎng)后上清液的NGF和NT-3含量居中。經(jīng)過共培養(yǎng)后BMSCs比單獨培養(yǎng)時MMP-2、MMP-9和MMP-13表達量降低而MAP-2、GFAP、Tuj1表達量增高;Nestin先降低，后升高，而NSF-1先升高后降低。

8、經(jīng)過共培養(yǎng)后OM-NSCs比單獨培養(yǎng)時NSF-1表達量降低而Nestin、MAP-2、GFAP、Tuj1、MMP-2、MMP-9和MMP-13表達量增高。所有干細胞都會對降低炎癥因子刺激后神經(jīng)元的凋亡率，其中兩種干細胞混合后的效果最為明顯。
　　結(jié)論:
　　兩種干細胞直接共培養(yǎng)后分泌的生長因子可互為補充。在非接觸共培養(yǎng)條件下，BMSCs可以幫助OM-NSCs維持干性，OM-NSCs則會促進BMSCs的神經(jīng)分化。OM-NSCs

9、使得BMSCs遷徙能力下降，而BMSCs會促進OM-NSCs遷徙能力的提高。兩種干細胞混合后，對神經(jīng)元的抗凋亡能力的保護最為明顯。
　　第三部分:嗅粘膜來源神經(jīng)干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合移植在治療大鼠脊髓損傷中的作用
　　目的:
　　觀察嗅粘膜來源神經(jīng)干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合移植對大鼠脊髓損傷的治療效果，并與骨髓間充質(zhì)干細胞或嗅鞘細胞單獨移植進行比較。
　　方法:
　　制備大鼠下胸段脊髓打擊損傷模型。

10、將造模的大鼠隨機分為4組，組1，單純BMSCs移植治療組;組2，單純ONSCs移植治療組;組3，BMSCs和ONSCs共移植治療組（兩種細胞比例1∶1）;組4，無菌PBS緩沖溶液注射陰性對照組。在造模后立即進行細胞移植，即在損傷部位周圍注射4×104個細胞進行治療。于細胞移植前、移植后第1天、第3天、第7天、第14天對大鼠進行運功功能評估。在移植后14天后處死大鼠，取脊髓病理標本進免疫熒光染色進行評估。
　　結(jié)果:
　　細胞

11、移植后第14天，對照組、BMSCs移植組、OM-NSCs移植組和BMSCs+OM-NSCs移植組的BBB評分分別為5.6±0.8、7.6±1.1、9.6±1.5和10.8±1.3。其中治療組的評分均較移對照組有明顯改善。BMSCs和OM-NSCs聯(lián)合移植組的BBB評分較兩個單一干細胞移植組明顯升高。免疫熒光顯示移植的BMSCs和OM-NSCs均能遷移至脊髓損傷區(qū)，并能在損傷區(qū)存活。
　　結(jié)論:
　　大鼠嗅粘膜來源神經(jīng)干細胞和