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文檔簡介
1、目的:本研究通過構(gòu)建犬年輕恒牙慢性根尖周炎(chronic apical periodontitis,CAP)模型,使用改良的三聯(lián)抗生素糊劑行根管消毒后刺激根尖出血,添加自體牙髓干細胞和富血小板纖維蛋白,并通過影像學(xué)、機械力學(xué)、組織學(xué)檢測探究根管內(nèi)新生組織的構(gòu)成,以及通過添加不同的因子,探討改進該法的可能性。
方法:健康6月齡Beagle犬4只,選擇雙側(cè)上頜第3切牙作為DPSCs(dental pulp stem cells)
2、來源,采用并改良Gronthos等報道的方法進行Beagle犬原代cDPSCs的分離、培養(yǎng),并進行表型鑒定及GFP(green fluorescent protein)基因的轉(zhuǎn)染。參照Choukroun的方法制備自體PRF(platelet-rich fibrin)。每只犬上頜雙側(cè)第2、3前磨牙,下頜雙側(cè)第2、3、4前磨牙作為實驗牙,成功建立CAP模型后采用改良的三聯(lián)抗生素糊劑進行根管消毒。實驗分為空白對照組和4組實驗組,A組:bloo
3、d clot組,B組:PRF組,C組:cDPSCs組,D組:PRF+cDPSCs組。在刺激根尖出血的基礎(chǔ)上添加cDPSCs和PRF,并用MTA(mineral trioxide aggregate)與復(fù)合樹脂封閉冠部。3個月后,采用平行投照的方法拍攝根尖X線片,觀察CAP的愈合情況,并通過Image J軟件測量術(shù)前術(shù)后牙根長度和管壁厚度的變化;使用萬能材料試驗機測量實驗牙的抗折強度,通過與正常牙的對比,評估該法對恢復(fù)牙齒抗折強度的效果;
4、通過對實驗牙進行HE染色,探明根管內(nèi)新生組織的組成成分及來源。
結(jié)果:
?。?)cDPSCs分離、培養(yǎng)、鑒定結(jié)果:Beagle犬牙髓組織分離3 d后可觀察到cDPSCs貼壁生長。cDPSCs的增殖曲線符合細胞對數(shù)生長曲線。細胞表面標(biāo)記物 CD146、STRO-1和Vimentin檢測均表達陽性。
(2)cDPSCs多向分化誘導(dǎo)結(jié)果:cDPSCs的成牙本質(zhì)/骨分化誘導(dǎo),茜素紅染色呈強陽性,可見有大量暗紅色礦化結(jié)
5、節(jié)散在分布。cDPSCs的成脂分化誘導(dǎo),油紅O染色陽性,可見暗紅色圓形油脂滴,呈串珠狀。
?。?)GFP基因轉(zhuǎn)染結(jié)果:GFP轉(zhuǎn)染48 h后實驗組細胞的轉(zhuǎn)染效率已達到80%~90%,但與對照組相比,實驗組細胞的生長增殖速率有所減緩,且形態(tài)發(fā)生一定的改變。
(4)改良的TAP(triple antibiotic paste)根管消毒結(jié)果:TAP消毒3 W后,38顆實驗牙仍有3顆炎癥未控制。根管沖洗液進行細菌學(xué)培養(yǎng),在需氧條
6、件下均無菌落形成,而在厭氧環(huán)境中,有一個根管來源的培養(yǎng)基出現(xiàn)白色菌落,革蘭氏染色呈紅色。
?。?)根尖X線片結(jié)果:實驗組都出現(xiàn)了根尖暗影愈合,根尖閉合趨勢,但差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。
(6)Image J軟件測量結(jié)果:在牙根增加長度、管壁增加厚度上,4組實驗組與對照組間存在顯著性差異(P<0.01),實驗組均低于對照組,各實驗組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。
?。?)抗折強度測試結(jié)果:4組實驗
7、組與對照組間存在顯著性差異(P<0.01),4組實驗組的折裂力值均低于對照組。B組、C組、D組與A組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。
?。?)HE染色結(jié)果:實驗牙根管內(nèi)均有血管、類牙骨質(zhì)、類骨以及類牙周膜等組織生成,但未發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)的形成。4個實驗組在根管內(nèi)新生物的組成和數(shù)量上無差別。熒光顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)有綠色熒光的組織或細胞。
結(jié)論:
(1)采用并改良 Gronthos等的方法分離、培養(yǎng) cDPSCs具有
8、很強的自我增殖能力和多向分化能力;
?。?)改良的TAP首次運用于動物實驗中,對感染根管有良好的消毒作用;
(3)首次運用慢病毒載體介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)染cDPSCs的方法并不適用于牙髓血管再生術(shù)中新生組織來源的研究;
(4)在傳統(tǒng)牙髓血管再生術(shù)刺激根尖出血的基礎(chǔ)上添加自體PRF和cDPSCs3個月后,證實了根管內(nèi)的新生物的構(gòu)成仍主要是類牙骨質(zhì)、類骨及類牙周膜等組織,未發(fā)現(xiàn)有牙本質(zhì)的形成;牙抗折強度恢復(fù)到正常水平
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