免疫細胞化學染色聯合激光掃描共聚焦顯微鏡技術檢測結核抗原在結腦診斷中的價值.pdf

1、目的:結核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM),是由結核分枝桿菌引起的中樞神經系統感染性疾病,是結核病中最嚴重的類型之一,致殘率和致死率較高。近年來由于多重耐藥結核菌的流行、人類免疫缺陷病毒的感染及貧窮等多種因素的影響,結腦的發(fā)病率呈日益回升的趨勢。早期診斷、早期治療是影響預后的關鍵。但結腦的診斷,尤其是早期診斷比較困難,腦脊液(CSF)中檢測到結核分枝桿菌可作為結腦診斷的“金標準”,但涂片抗酸染色和結核菌培

2、養(yǎng)陽性率很低,對臨床早期診斷價值有限。目前尚無一種可靠實用的診斷方法能夠滿足臨床診斷的需要。結核分枝桿菌侵入機體后被單核巨噬細胞吞噬,體內首先出現的是結核分枝桿菌特異性抗原,故結核抗原的檢測可以作為結核桿菌存在的直接證據。本實驗通過對腦脊液單核細胞內的ESAT-6和PPD兩種結核抗原的檢測,比較兩者對結核性腦膜腦炎的診斷價值,為結核性腦膜腦炎的診斷尋求一種更有效的方法。
　　 方法:病例組為35例臨床診斷為結核性腦膜炎患者,對照

3、組為35例非結核性腦膜炎患者。所有患者均進行腦脊液常規(guī)、生化、細胞學檢查及阿利新蘭染色,并應用免疫細胞化學染色法和免疫熒光雙標記染色法檢測腦脊液單核細胞內的ESAT-6及PPD抗原,以Shandon Cytospin4離心沉淀儀收集腦脊液細胞。免疫細胞化學染色采用SP法,置于普通光學顯微鏡下觀察,單核細胞的胞漿內有棕黃色或黃褐色顆粒沉積的為陽性,單核細胞的胞漿無色為陰性結果。免疫熒光雙標記染色法以Cy5和FITC熒光二抗及4,6-二脒基

4、-2-苯基吲哚(DAPI)分別標記抗ESAT-6單抗、抗PPD多抗及所有細胞核DNA,置于激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)下觀察,ESAT-6陽性的單核細胞呈胞核藍色、胞漿紅色;PPD陽性的單核細胞呈現出胞核藍色、胞漿綠色的完整結構;陰性細胞只出現藍色的胞核結構。
　　 結果:
　　 1、臨床資料
　　 結腦患者可表現為發(fā)熱、頭疼、腦膜刺激征陽性、腦局灶體征、意識障礙等,但卻乏特異性,不易于其它神經系統疾病相鑒別

5、,合并顱外結核支持結腦的診斷。
　　 2、腦脊液常規(guī)、生化檢查結果
　　 結腦組,總細胞數平均502.60±457.67×106/L;白細胞數平均為310.37±292.20×106/L;葡萄糖平均為1.87±0.87mmol/L;蛋白平均為1.62±0.65g/L;氯化物平均為109.68±9.25mmol/L;腰穿壓力平均為277.19±93.56mmH2O。對照組,總細胞數平均473.63±1545.95×106/

6、L;白細胞數平均為132.37±293.46×106/L;葡萄糖平均為2.91±0.95mmol/L;蛋白含量平均為0.76±0.79g/L;氯化物平均為119.25±6.76mmol/L;腰穿壓力平均為225.56±122.38mmH2O。
　　 結腦組腦脊液中的白細胞數、蛋白含量較對照組明顯升高,P＜0.05,差異有統計學意義;結腦組葡萄糖、氯化物含量與對照組比較,明顯降低,P＜0.05,差異有統計學意義;腦脊液總細胞數和腰

7、穿壓力兩組比較差異無統計學意義。
　　 3、腦脊液細胞學表現
　　 結腦組,35例患者中有25例為混合細胞學反應,8例以嗜中性粒細胞反應為主,2例是以淋巴細胞反應為主。對照組,35例患者中有5例為混合細胞學反應,5例以嗜中性粒細胞反應為主,18例以淋巴細胞反應為主,4例呈激活單核樣細胞學反應,3例腦脊液細胞學正常。結腦組混合細胞學反應約占71.43％,明顯高于對照組14.29％,混合細胞學反應對診斷結腦有重要的意義,動態(tài)

8、觀察腦脊液細胞學的變化,對結腦的治療及判斷預后有一定的應用價值。
　　 4、腦脊液單核細胞內ESAT-6抗原的檢測
　　 35例結核性腦膜炎患者中,經免疫細胞化學染色有29例陽性,對照組中有2例陽性,ESAT-6抗原的敏感性為82.86％,特異性為94.29％,病例組與對照組比較,P＜0.05,差異有統計學意義;經免疫熒光雙標記染色病例組中28例陽性,對照組中有l(wèi)例陽性,ESAT-6的敏感性為80％,特異性為97.14％

9、,病例組與對照組經統計分析P＜0.05,差異有統計學意義;兩種方法聯合檢測ESAT-6抗原,病例組中有30例陽性,對照組中有2例陽性,敏感性為85.71％,特異性為94.26％。
　　 5、腦脊液單核細胞內PPD抗原的檢測
　　 病例組中,免疫細胞化學染色有30例陽性,對照組中有6例陽性,PPD的敏感性為85.71％,特異性為82.86％,病例組與對照組比較,P＜0.05,差異有統計學意義;在免疫熒光雙標記染色中有29例

10、陽性,對照組中有5例陽性,PPD的敏感性為82.86％,特異性為85.71％,兩組相比較,P＜0.05,差異有統計學意義;兩種方法聯合檢測PPD抗原,病例組中有31例陽性,對照組中有8例陽性,敏感性為88.57％,特異性為77.14％。
　　 6、ESAT-6及PPD抗原診斷TBM優(yōu)劣比較
　　 免疫細胞化學染色聯合免疫熒光雙標記染色,檢測ESAT-6和PPD抗原,將兩者的敏感性和特異性分別進行X2檢驗,敏感性P＞0.0

11、5,差異無統計學意義,特異性P＜0.05,差異有統計學意義。故兩種方法聯合檢測ESAT-6抗原的特異性大于PPD抗原。
　　 結論:結核性腦膜炎患者腦脊液單核細胞內存在結核抗原,結核抗原的檢測可為結腦的早期診斷提供有力的依據。免疫細胞化學染色法聯合免疫熒光雙標記染色法可提高檢出率,其檢測ESAT-6抗原的敏感性為85.71％,特異性為94.26％;檢測PPD抗原的敏感性為88.57％,特異性為77.14％,經統計分析兩種方法聯合