大鼠視網(wǎng)膜色素變性對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞影響的研究.pdf

1、在脊椎動(dòng)物中，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞位于視網(wǎng)膜神經(jīng)層和脈絡(luò)膜之間，呈不規(guī)則多邊形，單層緊密排列，其尖端微絨毛與感光細(xì)胞的光敏感外節(jié)廣泛連接，使信息在RPE細(xì)胞和感光細(xì)胞之間有效傳遞。RPE細(xì)胞能與感光細(xì)胞交換視色素，吞噬感光細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，并且為感光細(xì)胞運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜功能中起到重要作用，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的破壞是導(dǎo)致許多視網(wǎng)膜疾病的病理基礎(chǔ)。如我國(guó)常見的致

2、盲性疾病視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)和老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)，其發(fā)病的起始原因就是RPE細(xì)胞功能缺陷。還有其他一些疾病也認(rèn)為與RPE變性有關(guān)，如Stargardt病、視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)性不良和色素性視網(wǎng)膜炎。這些疾病目前尚無(wú)有效的治療方法。
　　以往對(duì)此類RPE變性類疾病動(dòng)物模型特別是急性損傷模型的研究大都集中在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和感光

3、細(xì)胞，對(duì)內(nèi)層神經(jīng)元細(xì)胞的觀察卻鮮有報(bào)道。我們必須意識(shí)到視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的完整性對(duì)治療RPE變性類疾病的重要性，如視網(wǎng)膜移植和視網(wǎng)膜假體治療，只有足夠健康的內(nèi)層視網(wǎng)膜存在，視覺信號(hào)才能從修復(fù)的外核層傳入視網(wǎng)膜內(nèi)，若內(nèi)層視網(wǎng)膜功能缺失，視功能是不能有效恢復(fù)的。因此，RPE變性類疾病中視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的形態(tài)和功能究竟發(fā)生了什么改變，這些改變是由病變因素直接引起的還是繼發(fā)于RPE細(xì)胞和感光細(xì)胞變性的表現(xiàn)，其分子機(jī)制是什么，都是需要闡明的問題。<

4、br>　　此外，Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜中主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，具有重要的生理功能，如結(jié)構(gòu)支持、調(diào)節(jié)滲透壓平衡、參與神經(jīng)元細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸和代謝，以及調(diào)節(jié)血——視網(wǎng)膜屏障等作用。近年來(lái)研究表明，Müller細(xì)胞在形態(tài)和功能上都具有視網(wǎng)膜前體細(xì)胞特性，被認(rèn)為是一種視網(wǎng)膜內(nèi)源性干細(xì)胞。在某些低等脊椎動(dòng)物中，在特定條件刺激下Müller細(xì)胞能逆分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞和重新進(jìn)入細(xì)胞周期，并轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元，使損傷的視網(wǎng)膜完全修復(fù)。但在哺乳動(dòng)物中，

5、要在視網(wǎng)膜損傷后激活Müller細(xì)胞逆分化增殖異常困難，獲得逆分化Müller細(xì)胞的數(shù)量也是很有限的，之后Müller細(xì)胞很快在視網(wǎng)膜下腔形成膠質(zhì)瘢痕，加快了病變發(fā)展。那么在RPE變性類疾病中，Müller細(xì)胞是否也具有視網(wǎng)膜前體細(xì)胞特性，其分子機(jī)制是什么，怎樣阻止Müller細(xì)胞膠質(zhì)化，啟動(dòng)Müller細(xì)胞逆分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元細(xì)胞以修復(fù)受損的視網(wǎng)膜，是我們想探索的問題。
　　基于上述研究現(xiàn)狀，本研究采用急性

6、視網(wǎng)膜色素變性模型:碘酸鈉(NaIO3)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷模型，和慢性視網(wǎng)膜色素變性模型:皇家外科學(xué)院大鼠(Royal college ofsurgeonrat，RCS)，探討大鼠急性視網(wǎng)膜色素變性過程中內(nèi)層神經(jīng)元的變化及其分子機(jī)制和慢性視網(wǎng)膜色素變性過程中Müller細(xì)胞的變化及其逆分化分子機(jī)制。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　一、大鼠急性視網(wǎng)膜色素變性對(duì)內(nèi)層神經(jīng)元細(xì)胞影響的研究。我們發(fā)現(xiàn)在模型建立早期階段視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元就可以

7、被NaIO3損傷并且其形態(tài)也會(huì)發(fā)生明顯的改變，多巴能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(dopaminergic amacrine cells，DA-ACs)、水平細(xì)胞、表達(dá)視黑素的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(melanopsin-expressing retinal ganglion cells，mRGCs)的樹突野均減小。與此同時(shí)，NaIO3也對(duì)中腦多巴能神經(jīng)元最豐富的區(qū)域腹側(cè)被蓋區(qū)(ventraltegmental area，VTA)和黑質(zhì)致密部(Substant

8、ia Nigra Pars Compacta，SNpc)造成損害，間接說明視網(wǎng)膜中DA-ACs的損傷是也存在直接性機(jī)制。此外，我們發(fā)現(xiàn)注射NaIO3之后，被認(rèn)為在中腦多巴能神經(jīng)元特異性表達(dá)的mir-133b在視網(wǎng)膜DA-ACs中表達(dá)明顯上調(diào)。過表達(dá)的mir-133b抑制了一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子pitx3的表達(dá)，并導(dǎo)致視網(wǎng)膜多巴能系統(tǒng)一系列的缺失，如下調(diào)酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)、D2受體的表達(dá)和多巴胺(D

9、opamine，DA)的生產(chǎn)，這可能是DA-ACs、水平細(xì)胞和mRGCs出現(xiàn)病理學(xué)表現(xiàn)的主要原因。當(dāng)mir-133b受到mir-133b/RNAi的干擾后，上述這些缺失減少了，DA-ACs和mRGCs樹突野也有所恢復(fù)，而且視網(wǎng)膜電圖(Electroretinogram，ERG)的b波平均幅值和OPs波總幅值也明顯提高，提示視功能得到一定改善。
　　二、大鼠慢性視網(wǎng)膜色素變性對(duì)Müller細(xì)胞的影響及其逆分化機(jī)制的研究。我們觀察到在

10、RCS大鼠視網(wǎng)膜變性早期，Müller細(xì)胞可短暫表達(dá)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白，但很快獲得膠質(zhì)命運(yùn)，加重了視網(wǎng)膜的病變發(fā)展。初步研究表明let-7家族分子let-7e和let-7i在病變視網(wǎng)膜中顯著高表達(dá)。let-7家族轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是由RNA結(jié)合蛋白Lin28B調(diào)控，研究進(jìn)一步證實(shí)了Lin28B而非Lin28A在這個(gè)過程中下調(diào)，Lin28B下調(diào)是導(dǎo)致let-7e和let-7i高表達(dá)的重要因素。Lin28B在體內(nèi)或體外異位表達(dá)都會(huì)抑制let-7

11、e和let-7i的高表達(dá)，從而動(dòng)員Müller細(xì)胞逆分化、增殖，促進(jìn)逆分化Müller細(xì)胞的神經(jīng)元命運(yùn)，抑制膠質(zhì)命運(yùn)。ERG檢測(cè)表明a波和b波都有所恢復(fù)。我們的數(shù)據(jù)第一次證明在RCS大鼠視網(wǎng)膜病變模型中下調(diào)Lin28B同時(shí)上調(diào)let-7e和let-7i可能是影響視網(wǎng)膜再生修復(fù)的重要原因。
　　綜上所述，我們得出以下結(jié)論:
　　一、 NaIO3誘導(dǎo)大鼠急性視網(wǎng)膜色素變性過程中，視網(wǎng)膜內(nèi)層各種神經(jīng)元細(xì)胞受到不同程度損害，這種損害

12、不僅源于感光細(xì)胞輸入信息的丟失，也受病變因素的直接影響。
　　二、 NaIO3誘導(dǎo)大鼠急性視網(wǎng)膜色素變性過程中，DA-ACs的形態(tài)和功能受到嚴(yán)重影響，進(jìn)而導(dǎo)致mRGCs繼發(fā)性損害。
　　三、 NaIO3誘導(dǎo)大鼠急性視網(wǎng)膜色素變性過程中，miR-133b過表達(dá)并下調(diào)其下游轉(zhuǎn)錄因子pitx3的表達(dá)水平是造成DA-ACs和mRGCs損傷的重要原因。
　　四、 RCS大鼠視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞在病變?cè)缙诰哂幸暰W(wǎng)膜前體細(xì)胞特性