大鼠視網膜色素變性對視網膜內層神經元和膠質細胞影響的研究.pdf

1、在脊椎動物中，視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞位于視網膜神經層和脈絡膜之間，呈不規(guī)則多邊形，單層緊密排列，其尖端微絨毛與感光細胞的光敏感外節(jié)廣泛連接，使信息在RPE細胞和感光細胞之間有效傳遞。RPE細胞能與感光細胞交換視色素，吞噬感光細胞的代謝產物，并且為感光細胞運輸營養(yǎng)物質。因此，RPE細胞在視網膜功能中起到重要作用，其細胞結構完整性的破壞是導致許多視網膜疾病的病理基礎。如我國常見的致

2、盲性疾病視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)和老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)，其發(fā)病的起始原因就是RPE細胞功能缺陷。還有其他一些疾病也認為與RPE變性有關，如Stargardt病、視網膜營養(yǎng)性不良和色素性視網膜炎。這些疾病目前尚無有效的治療方法。
　　以往對此類RPE變性類疾病動物模型特別是急性損傷模型的研究大都集中在視網膜色素上皮細胞和感光

3、細胞，對內層神經元細胞的觀察卻鮮有報道。我們必須意識到視網膜內層神經元的完整性對治療RPE變性類疾病的重要性，如視網膜移植和視網膜假體治療，只有足夠健康的內層視網膜存在，視覺信號才能從修復的外核層傳入視網膜內，若內層視網膜功能缺失，視功能是不能有效恢復的。因此，RPE變性類疾病中視網膜內層神經元的形態(tài)和功能究竟發(fā)生了什么改變，這些改變是由病變因素直接引起的還是繼發(fā)于RPE細胞和感光細胞變性的表現(xiàn)，其分子機制是什么，都是需要闡明的問題。<

4、br>　　此外，Müller細胞作為視網膜中主要的神經膠質細胞，具有重要的生理功能，如結構支持、調節(jié)滲透壓平衡、參與神經元細胞營養(yǎng)運輸和代謝，以及調節(jié)血——視網膜屏障等作用。近年來研究表明，Müller細胞在形態(tài)和功能上都具有視網膜前體細胞特性，被認為是一種視網膜內源性干細胞。在某些低等脊椎動物中，在特定條件刺激下Müller細胞能逆分化為視網膜前體細胞和重新進入細胞周期，并轉分化為視網膜神經元，使損傷的視網膜完全修復。但在哺乳動物中，

5、要在視網膜損傷后激活Müller細胞逆分化增殖異常困難，獲得逆分化Müller細胞的數量也是很有限的，之后Müller細胞很快在視網膜下腔形成膠質瘢痕，加快了病變發(fā)展。那么在RPE變性類疾病中，Müller細胞是否也具有視網膜前體細胞特性，其分子機制是什么，怎樣阻止Müller細胞膠質化，啟動Müller細胞逆分化為視網膜前體細胞，并且轉分化為神經元細胞以修復受損的視網膜，是我們想探索的問題。
　　基于上述研究現(xiàn)狀，本研究采用急性

6、視網膜色素變性模型:碘酸鈉(NaIO3)誘導視網膜損傷模型，和慢性視網膜色素變性模型:皇家外科學院大鼠(Royal college ofsurgeonrat，RCS)，探討大鼠急性視網膜色素變性過程中內層神經元的變化及其分子機制和慢性視網膜色素變性過程中Müller細胞的變化及其逆分化分子機制。
　　主要研究結果如下:
　　一、大鼠急性視網膜色素變性對內層神經元細胞影響的研究。我們發(fā)現(xiàn)在模型建立早期階段視網膜內層神經元就可以

7、被NaIO3損傷并且其形態(tài)也會發(fā)生明顯的改變，多巴能無長突細胞(dopaminergic amacrine cells，DA-ACs)、水平細胞、表達視黑素的視網膜神經節(jié)細胞(melanopsin-expressing retinal ganglion cells，mRGCs)的樹突野均減小。與此同時，NaIO3也對中腦多巴能神經元最豐富的區(qū)域腹側被蓋區(qū)(ventraltegmental area，VTA)和黑質致密部(Substant

8、ia Nigra Pars Compacta，SNpc)造成損害，間接說明視網膜中DA-ACs的損傷是也存在直接性機制。此外，我們發(fā)現(xiàn)注射NaIO3之后，被認為在中腦多巴能神經元特異性表達的mir-133b在視網膜DA-ACs中表達明顯上調。過表達的mir-133b抑制了一個重要的轉錄因子pitx3的表達，并導致視網膜多巴能系統(tǒng)一系列的缺失，如下調酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)、D2受體的表達和多巴胺(D

9、opamine，DA)的生產，這可能是DA-ACs、水平細胞和mRGCs出現(xiàn)病理學表現(xiàn)的主要原因。當mir-133b受到mir-133b/RNAi的干擾后，上述這些缺失減少了，DA-ACs和mRGCs樹突野也有所恢復，而且視網膜電圖(Electroretinogram，ERG)的b波平均幅值和OPs波總幅值也明顯提高，提示視功能得到一定改善。
　　二、大鼠慢性視網膜色素變性對Müller細胞的影響及其逆分化機制的研究。我們觀察到在

10、RCS大鼠視網膜變性早期，Müller細胞可短暫表達視網膜前體細胞標志蛋白，但很快獲得膠質命運，加重了視網膜的病變發(fā)展。初步研究表明let-7家族分子let-7e和let-7i在病變視網膜中顯著高表達。let-7家族轉錄后調控是由RNA結合蛋白Lin28B調控，研究進一步證實了Lin28B而非Lin28A在這個過程中下調，Lin28B下調是導致let-7e和let-7i高表達的重要因素。Lin28B在體內或體外異位表達都會抑制let-7

11、e和let-7i的高表達，從而動員Müller細胞逆分化、增殖，促進逆分化Müller細胞的神經元命運，抑制膠質命運。ERG檢測表明a波和b波都有所恢復。我們的數據第一次證明在RCS大鼠視網膜病變模型中下調Lin28B同時上調let-7e和let-7i可能是影響視網膜再生修復的重要原因。
　　綜上所述，我們得出以下結論:
　　一、 NaIO3誘導大鼠急性視網膜色素變性過程中，視網膜內層各種神經元細胞受到不同程度損害，這種損害

12、不僅源于感光細胞輸入信息的丟失，也受病變因素的直接影響。
　　二、 NaIO3誘導大鼠急性視網膜色素變性過程中，DA-ACs的形態(tài)和功能受到嚴重影響，進而導致mRGCs繼發(fā)性損害。
　　三、 NaIO3誘導大鼠急性視網膜色素變性過程中，miR-133b過表達并下調其下游轉錄因子pitx3的表達水平是造成DA-ACs和mRGCs損傷的重要原因。
　　四、 RCS大鼠視網膜中Müller細胞在病變早期具有視網膜前體細胞特性