石斛散對視網(wǎng)膜色素變性治療作用的實驗研究.pdf

1、目的：從體內(nèi)動物實驗和體外培養(yǎng)細(xì)胞實驗兩個方面，系統(tǒng)觀察補腎益精類中藥方劑石斛散對視網(wǎng)膜變性動物變性過程的干預(yù)作用及視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護，深入分析其在感光細(xì)胞凋亡過程中的作用靶點及程度，旨在從不同角度探求中藥治療視網(wǎng)膜色素變性的效果與機制，為臨床用藥提供客觀依據(jù)和指導(dǎo)，同時也為今后研究中藥防治視網(wǎng)膜變性類疾病提供新的思路和方法。 方法：1體內(nèi)動物實驗研究：以先天性視網(wǎng)膜變性rds小鼠作為動物模型，采用組織病理學(xué)技術(shù)(光、電鏡

2、)、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)和視網(wǎng)膜電圖(ERG)方法觀察石斛散作用后視網(wǎng)膜組織形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、感光細(xì)胞凋亡以及視網(wǎng)膜功能的變化。用real-time熒光定量PCR的方法研究石斛散治療rds小鼠后各時間點凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2、Caspase-3和c-fos的變化。 2體外培養(yǎng)細(xì)胞研究：體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，采用MTT法分析石斛散及各單味中藥對細(xì)胞活性的影響。用流式細(xì)胞儀觀察石斛散對視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的保護作用

3、。采用激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal)技術(shù)，分別以羅丹明123和Fluo3/AM為熒光探針，分析石斛散對谷氨酸損傷前后細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)及胞內(nèi)鈣變化的影響。 結(jié)果：1石斛散對視網(wǎng)膜色素變性動物模型rds鼠的干預(yù)作用的研究①石斛散治療rds小鼠光鏡結(jié)果：14天時對照組視網(wǎng)膜發(fā)育較完善，感光細(xì)胞有10～12層左右，排列整齊有序。石斛散組14天時，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)和厚度與空白對照組相比無差異。28天時，對照組感光細(xì)胞層變

4、薄，約有9層左右，細(xì)胞排列有些紊亂。石斛散組感光細(xì)胞層及內(nèi)核層較2周時變薄，感光細(xì)胞數(shù)目減少。但與對照組比較感光細(xì)胞層較厚，細(xì)胞數(shù)目也較多，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。56天時，對照組感光細(xì)胞層約有6層左右，細(xì)胞排列紊亂。石斛散組較28天時厚度有所變薄，感光細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞排列較前有所紊亂，相當(dāng)于對照組28天的水平。4月時，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化更加明顯，感光細(xì)胞層約有3～4層左右，排列紊亂，內(nèi)核層變薄。在觀察期間，兩組感光細(xì)胞節(jié)段層均較薄，

5、未見明顯發(fā)育。 ②石斛散治療rds小鼠電鏡結(jié)果：14天時，TEM觀察：對照組視網(wǎng)膜節(jié)段層未見有外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)，偶爾有細(xì)胞凋亡的早期核變化。28天時，TEM觀察：對照組節(jié)段層有結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象，內(nèi)節(jié)和纖毛崩解，未見外節(jié)膜盤，外核層細(xì)胞凋亡的核變化較14天時更加明顯，外核層有部分線粒體變性。石斛散組也有一些早期凋亡的細(xì)胞，但細(xì)胞變性相對較少。56天時，TEM觀察：對照組的外核層細(xì)胞明顯減少，僅見5～6層細(xì)胞。內(nèi)節(jié)和纖毛結(jié)構(gòu)紊亂，纖毛脫落的

6、更加明顯，許多細(xì)胞核有凋亡改變，線粒體變性明顯，內(nèi)核層細(xì)胞也有細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，石斛散組表現(xiàn)為變性細(xì)胞增多，細(xì)胞核的凋亡改變增多，與對照組相比，外核層中細(xì)胞核染色質(zhì)相對均勻分布，未變性細(xì)胞相對較多。內(nèi)核層細(xì)胞變性較對照組輕。 ③石斛散治療rds小鼠TUNEL結(jié)果：14天時，對照組rds小鼠外核層出現(xiàn)少量散在的棕黑色陽性細(xì)胞，而石斛散組14天陽性細(xì)胞少見，兩組細(xì)胞陽性率分別是2.04﹪及1.81﹪，統(tǒng)計學(xué)分析差異無顯著性。28天時，

7、兩組外核層陽性細(xì)胞數(shù)均較14天明顯增多，內(nèi)核層也出現(xiàn)了陽性染色，兩組的感光細(xì)胞陽性率分別是6.27﹪及3.46﹪，統(tǒng)計學(xué)分析兩者差異有顯著性(P＜0.05)。56天時，對照組rds鼠外核層明顯變薄，細(xì)胞量減少，內(nèi)外核層均有較多的陽性細(xì)胞，兩組感光細(xì)胞陽性率分別為15.8﹪及8.53﹪。統(tǒng)計學(xué)分析兩者差異有顯著性(P＜0.05)。 ④石斛散治療rds小鼠視網(wǎng)膜電圖(ERG)結(jié)果：不同日齡rds鼠的Max-ERG變化有所不同，正常出

8、生后56天(P56)視為成年鼠，P56時小鼠的電生理反應(yīng)為較穩(wěn)定，波幅較高的時期。但rds鼠是一種有視網(wǎng)膜疾病的小鼠，從Max-ERG的b波和a波上可以看出，其在P28左右波幅最高，達51.8±12.4。而到P56時a、b波均降低，而P14時波幅更低，這可能和日齡較低有關(guān)。Cone反應(yīng)波形未引出。與正常C57小鼠相比，各年齡段波幅均明顯偏低，而潛時明顯延長。石斛散治療的各日齡組小鼠Max-ERG與對照組有相似變化規(guī)律，但各日齡組與對照組

9、比較無統(tǒng)計學(xué)差異z (P＞0.05)。 ⑤石斛散對rds鼠變性過程中凋亡相關(guān)基因表達的影響：對照組rds鼠的bax的表達含量明顯高于其它三個凋亡相關(guān)基因，并隨日齡增長，而bcl-2在rds鼠中的含量相對較低，28天和56天的含量高于14天時，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)。Caspase-3在28天和56天時明顯高于14天，56天時最高，達0.72±0.17。而c-fos在rds鼠的各期含量都較低，各日齡之間無統(tǒng)計學(xué)

10、差異。在石斛散干預(yù)組，56天時bax含量明顯低于對照組，有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(P＜0.05)，而其它兩個日齡組與對照組無差別。28天和56天時Caspase-3含量明顯低于對照組，有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。而對bcl-2和c-fos的含量與同期對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。 2石斛散對人視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞活性干預(yù)作用的研究：①石斛散對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞活性的影響：人視網(wǎng)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)12小時后開始貼壁，2～3天后細(xì)胞開始有伸展，培養(yǎng)

11、15～30天，細(xì)胞生長良好。作免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，神經(jīng)元特異烯醇酶(NSE)染色有65﹪細(xì)胞呈陽性，說明這些視網(wǎng)膜細(xì)胞中神經(jīng)細(xì)胞占大多數(shù)，而膠質(zhì)纖維酸蛋白(GFAP)染色陽性細(xì)胞占30﹪左右，細(xì)胞培養(yǎng)80天后，神經(jīng)元細(xì)胞逐漸死亡消失。MTT實驗：石斛散組1.58mg/ml和0.5mg/ml以及石斛組5mg/ml對人視網(wǎng)膜細(xì)胞有明顯促增殖(或活性)的作用，與藥物空白對照組有統(tǒng)計學(xué)顯著性，P＜0.05。其中0.5mg/ml石斛散作用最強，而其

12、它各濃度組以及蒼術(shù)、仙靈脾組未見明顯的促細(xì)胞增殖(或活性)作用。對照組NGF10～1000ng也有明顯促細(xì)胞增殖(或活性)作用。 ②石斛散對視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(FCM法)：在未加任何干預(yù)因素的對照組中，活細(xì)胞占61.32﹪；而死亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞占32.40﹪；早期凋亡細(xì)胞相對較少為6.23﹪。當(dāng)加入1mM谷氨酸后，活細(xì)胞明顯減少為44.23﹪，而死亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞增加為46.53﹪，與未加谷氨酸組相比有統(tǒng)計學(xué)顯著性

13、(P＜0.05)。預(yù)先給予石斛散干預(yù)的中藥組，活細(xì)胞(73.8﹪)明顯多于對照組，而其它各類細(xì)胞少于對照組。加入谷氨酸后，活細(xì)胞數(shù)量也減少，占58.91﹪，其它類別細(xì)胞增多，尤其是早期凋亡細(xì)胞比例較大，為16.7﹪，而死亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞占24.39﹪，與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。 ③石斛散對視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)的影響：先加石斛散能輕度升高MMP，再加谷氨酸同樣可使MMP降低，但降低幅度明顯低于

14、單純谷氨酸組，統(tǒng)計分析P＜0.01。若先用谷氨酸降低MMP，再加石斛散仍能使MMP輕度升高。 ④石斛散對視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子[Ca2+]i的影響：加入谷氨酸后，熒光強度較原基礎(chǔ)值增加88﹪。而加入石斛散后，熒光強度緩慢降低，較原基礎(chǔ)值降低14.8﹪。鈣離子拮抗劑維拉帕米降低幅度為57.3﹪。對先用谷氨酸干預(yù)的細(xì)胞，石斛散無明顯降低胞內(nèi)鈣的趨勢，而維拉帕米可使其降低26.9﹪。但預(yù)先用石斛散干預(yù)的細(xì)胞，再加入谷氨酸時，其升高

15、胞內(nèi)鈣離子的能力明顯降低，與未干預(yù)組比較有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01。 結(jié)論：1石斛散早期干預(yù)能夠改善先天性視網(wǎng)膜變性rds小鼠的組織細(xì)胞變性，對視網(wǎng)膜功能學(xué)方面未見明顯改善效果。對rds小鼠感光細(xì)胞變性過程中凋亡相關(guān)基因有影響作用，其中主要抑制bax基因和Caspase-3基因，而對bcl-2和c-fos基因無明顯作用。 2石斛散能夠通過調(diào)節(jié)線粒體代謝，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進細(xì)胞的生長，具有視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞保護作用