AngⅡ對延遲整流鉀電流慢成分的調節(jié)及其信號轉導機制.pdf

1、心肌肥厚、心力衰竭（簡稱心衰）常常伴發(fā)室性心律失常，心衰病人約一半以上因惡性心律失常的發(fā)生而猝死（即心性猝死Suddencardiacdeath，SCD）。心肌肥厚、心衰時發(fā)生病理性電生理重構，一個主要特征是動作電位時程（actionpotentialduration，APD）的延長。不同的原因所致的多種心肌肥厚和心衰的實驗動物模型及人的心室肌細胞均觀察到K+電流的下調。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensinsyste

2、m，RAS）在心肌肥厚的病理過程中具有重要作用，血管緊張素Ⅱ是該系統(tǒng)發(fā)揮主要作用的體液因子。已知血管緊張素Ⅱ是造成心臟組織肥厚性重構的重要原因，然而關于AngⅡ在心肌電重構、心律失常產生中的作用了解很少。
　　 越來越多的動物實驗表明，腎素.血管緊張素系統(tǒng)在房性和室性心律失常的病理過程中具有重要作用。在急性分離的大鼠和犬的心室細胞、及表達編碼Ito通道基因Kv4.3的哺乳細胞上，AngⅡ均可減小Ito電流密度。實驗表明，選擇性心

3、肌組織過表達AngⅡ基因的小鼠在不增加循環(huán)AngⅡ水平的情況下出現(xiàn)明顯復極化延遲，伴高發(fā)的室性心律失常；與上述結果相似，Rivard等新近報道，心臟特異性過表達人類ATI受體基因小鼠的Ito、IKur（一種超快激活的延遲整流K+電流）及IK1均下調，造成復極延遲，動作電位延長，伴自發(fā)室性心律失常。特別值得注意的是，年幼的轉基因動物即存在復極化延遲及高發(fā)的心律失常，而此時并不存在組織肥厚性重構，表明電生理改變并非繼發(fā)于肥厚性重構，而是刺激

4、ATI受體直接引起離子通道的改變。這些研究提示，AngⅡ直接對離子通道的調節(jié)作用可能是病理性電重構的重要因素。
　　 延遲整流鉀電流IK是哺乳動物和人的心室肌細胞動作電位主要的復極外向鉀電流，包括緩慢激活的延遲整流鉀電流（IKs）和快激活的延遲整流鉀電流（IKr）。目前認為，IKs通道分子是由4個KCNQ1成孔道基因（α-亞單位）及2個輔助KCNE1（β-亞單位）組成。KCNQ1和KCNE1突變分別與I型（LQT1）和V型（LQ

5、T5）先天性QT間期延長綜合征有關。心肌肥厚、慢性心力衰竭和心肌梗塞等引起的電重構，往往伴隨著IKs的減少，這就大大增加了致死性室性心律失常的發(fā)生。前期我們報道了，AngⅡ通過激動.AT1受體抑制豚鼠心室細胞IKr電流，此作用主要由細胞內PKC信號通路中介。然而AngⅡ對心室肌IKs的調控作用尚不清楚。本實驗利用全細胞膜片鉗技術，在急性分離的豚鼠心室肌細胞及表達通道α、β-亞單位cDNA的人胚胎腎細胞（HEK293）上，觀察了AngⅡ對

6、心室肌IKs的直接調控作用，并分析了其作用的細胞內分子機制。
　　 第一部分AngⅡ抑制心室肌細胞的緩慢激活延遲整流鉀（IKs）電流目的：觀察AngⅡ對豚鼠心室肌細胞IKs的影響。
　　 方法：在急性分離的豚鼠心室肌細胞，常規(guī)全細胞膜片鉗技術記錄IKs電流，觀察AngⅡ對IKs影響。
　　 結果：外液中加入AngⅡ（100nM）后，明顯減少了去極化外向電流及復極時的尾電流，當去極電壓為+40mV時，尾電流由給藥前

7、的0.77±0.07pA/pF減小到0.49±o.07pA/pF。抑制作用2-3min出現(xiàn)，5-10min左右達到穩(wěn)態(tài)，電流的抑制作用沖洗后不能完全恢復。AngⅡ以濃度依賴方式抑制IKs，以IKs尾電流抑制率為縱座標做出AngⅡ抑制IKs的量效曲線，經Hill方程擬合后得到IC50=8.2923nM。AngⅡ對電壓門控IKs通道半數(shù)激活電壓、激活及去激活時間常數(shù)都沒有影響。
　　 小結：AngⅡ抑制豚鼠心室肌的IKs電流，這種抑

8、制作用與通道的動力學特征無關。
　　 第二部分AngⅡ通過PKCε亞型調節(jié)IKs電流目的：觀察AngⅡ對豚鼠心室肌細胞IKs抑制作用的細胞內信號轉導通路。
　　 方法：在急性分離的豚鼠心室肌細胞上，全細胞膜片鉗技術記錄IKs電流，觀察不同的PKC抑制劑或激活劑對AngⅡ抑制IKs作用的影響。
　　 結果：AT1受體阻斷劑Losartan（1μM）幾乎完全取消AngⅡ對IKs電流的抑制作用，而AT2受體阻斷劑PD1

9、23319（1μM）則不影響AngⅡ的作用。PKC抑制劑Bis-1（100nM）和stausporine（100nM）明顯減弱AngⅡ對IKs電流的抑制作用；PKC激動劑PMA（100nM）也明顯減弱AngⅡ對IKs電流的抑制作用；細胞內Ca2+螯合劑BAPTA（20mM）并不影響AngⅡ對IKs的抑制作用；選擇性PKC亞型抑制劑G06976（100nM，選擇性抑制Ca2+敏感PKC亞型）和Go6983（100nM，抑制傳統(tǒng)型、新型PK

10、C6和非典型PKCζ，而不影響新型PKCε）不影響AngⅡ對IKs電流的抑制作用；PKCε亞型的轉位抑制劑εV1-2（100nM）明顯對抗了AngⅡ對IKs電流的抑制作用。
　　 小結：AngⅡ通過激動AT1受體、激活新型PKCε亞型而下調IKs通道功能。
　　 第三部分AngⅡ對KCNQ1/KCNE1通道的影響目的：分析AngⅡ對異源表達的KCNQ1/KCNE1通道電流影響及其分子機制。
　　 方法：采用脂質體

11、介導瞬時轉染方法，HEK293細胞共轉染人KCNQ1、KCNE1及AT1受體cDNA，觀察AngⅡ對通道電流的影響。
　　 結果：在轉染的HEK293細胞上，與豚鼠心室肌上觀察到的結果相似，AngⅡ激活AT1受體抑制KCNQ1/KCNE1電流，這種抑制作用可以被PKC抑制劑阻斷，并且AngⅡ不改變KCNQ1/KCNE1通道的電壓依賴性激活和通道的動力學特征。AngⅡ對單獨轉染α亞基的KCNQ1通道電流亦具有抑制作用，但抑制作用較

12、對KCNQ1/KCNE1通道的抑制作用減小，和對KCNQ1/KCNE1的抑制作用一樣，都未影響通道的電壓門控特征。鑒于KCNQ1/KCNE1/KCNE2三聚體通道動力學特征最接近KCNQ1/KCNE1通道，我們觀察了AngⅡ對KCNQ1/KCNE1/KCNE2通道電流的影響，發(fā)現(xiàn)AngⅡ對電流的抑制作用明顯減弱。
　　 小結：1.AngⅡ通過AT1受體激活PKC途徑抑制KCNQ1/KCNE1電流。2.KCNQ1/KCNE1通道的

13、α和β亞基可能共同參與了AngⅡ對通道的調控作用。3KCNE2可能存在AngⅡ調控的PKC磷酸化位點，但激活此位點可能上調通道功能。
　　 1.AngⅡ作用于AT1受體，經過PKC途經抑制心室肌細胞的IKs和表達的KCNQ1/KCNE1電流，AngⅡ的抑制作用不影響通道的動力學特征；
　　 2.PKCε是中介AngⅡ上述抑制作用的主要亞型；
　　 3.KCNQ1/KCNE1通道的α和β亞基可能共同參與了AngⅡ對