OPG對破骨細(xì)胞活性的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制.pdf

1、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)是腫瘤壞死因子受體超家族成員，它最主要的生物學(xué)作用是抑制體內(nèi)破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的分化、活化，并促進其發(fā)生凋亡。臨床試驗及動物實驗表明，重組OPG蛋白和OPG基因治療等技術(shù)手段，對防治人及動物的骨營養(yǎng)不良性疾病具有一定的應(yīng)用價值。但是關(guān)于OPG對OC的調(diào)控機制仍不完全清楚，對于OPG相關(guān)藥物的開發(fā)及其普遍運用仍存在諸多困難。本文以原代分離鴨胚OC及誘導(dǎo)獲取OC模型為研究

2、對象，在體外培養(yǎng)過程中添加不同濃度OPG，通過形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞活性檢測、實時熒光定量PCR(QRT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)等技術(shù)手段，研究OPG對OC分化、活性及凋亡中形態(tài)、功能、相關(guān)基因及關(guān)鍵信號蛋白的影響。本研究以期為OPG調(diào)控OC活性的機理提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容如下:
　　1.OPG對破骨細(xì)胞分化、活化及凋亡的影響
　　為了研究OPG對體外培養(yǎng)鴨胚OC分化、活化與凋亡的影響，收集23日齡鴨胚

3、骨髓細(xì)胞，體外培養(yǎng)過程中分組加入不同濃度OPG進行處理(A組:無因子;B組:30 ng/mL OPG;C組:100 ng/mL OPG)。通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)，骨吸收陷窩分析，OC骨架(TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，TRITC-eonjugated phalloidin)及胞核(Hoechst33258)染色技術(shù)，檢測TRAP陽性細(xì)胞、OC的骨吸收活性

4、以及OC凋亡狀態(tài)。結(jié)果顯示，三個實驗組中TRAP陽性細(xì)胞數(shù)、OC的骨吸收活性均在OPG處理7d后達(dá)到最高水平。與對照組相比，OPG處理組OC數(shù)目及OC的骨吸收活性顯著減弱(P＜0.05)，每個時間段骨吸收陷窩凈增長面積與OC數(shù)目變化趨勢一致。OPG能夠抑制OC內(nèi)纖維狀肌動蛋白環(huán)(Filamentous-actin rings，F(xiàn)-actin tings)的形成，并且能夠促進成熟OC內(nèi)F-actin環(huán)的崩解。此外，OPG能夠誘導(dǎo)成熟OC發(fā)

5、生凋亡，OC的形態(tài)及核發(fā)生改變。表明OPG能夠抑制OC細(xì)胞前體分化，促進成熟OC發(fā)生凋亡。
　　2.OPG抑制破骨細(xì)胞分化成熟的機理
　　為了研究OPG抑制OC分化、活化的分子生物學(xué)機理，在無血清培養(yǎng)條件下，采用M-CSF+RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化為OC。在培養(yǎng)過程中加入不同濃度OPG（0、10、20、50、100 ng/mL）進行處理。通過TRAP染色，OC內(nèi)F-actin環(huán)染色，骨吸收陷窩分析等技術(shù)，研

6、究OPG對OC的分化及活化的影響。此外，通過QRT-PCR技術(shù)檢測OPG對OC相關(guān)基因TRAP、RANK、MMP-9、CAⅡ、Cathepsin K表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，在無血清培養(yǎng)條件下，M-CSF+RANKL能夠誘導(dǎo)OC的分化與活化，并能夠促進OC分化及活化中TRAP、RANK、MMP-9、CAⅡ、Cathepsin K基因的表達(dá)，而OC的分化與活化受到OPG的抑制。
　　3.OPG抑制破骨細(xì)胞分化成熟的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

7、
　　為了研究OPG抑制OC分化中的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，采用M-CSF+RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化形成OC，在體外培養(yǎng)不同時間，各組分別添加相應(yīng)濃度的OPG。各時間點培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，提取總蛋白，通過Western blot法檢測MAPK信號通路中關(guān)鍵信號蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M-CSF+RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化形成OC過程中p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三種蛋白的磷酸化水平均上

8、升，在誘導(dǎo)處理15min后p38-MAPK磷酸化水平達(dá)最大值，誘導(dǎo)處理30 min后JNK-MAPK、ERK-MAPK磷酸化水平達(dá)最大值。不同濃度OPG均能夠抑制p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三種蛋白的磷酸化水平，且隨OPG濃度的增加抑制作用更加明顯。表明MAPK信號通路參與調(diào)控OC的分化與活化過程，且參與調(diào)控OPG抑制OC的分化與活化。
　　4.OPG抑制破骨細(xì)胞分化成熟的Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制
　　為

9、了研究OPG抑制OC分化中的Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，采用M-CSF+RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化形成OC，在體外培養(yǎng)不同時間，各組分別添加相應(yīng)濃度的OPG。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測OC胞內(nèi)[Ca2+]i，通過Western blot法檢測鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M-CSF+RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化形成OC過程中OC胞內(nèi)[Ca2+]i極顯著升高(P＜0.01)，