去甲腎上腺素和血管緊張素Ⅱ?qū)π募÷せ钛舆t整流鉀電流的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制.pdf

1、心臟疾病如心肌肥厚、心力衰竭發(fā)生時(shí)，可引發(fā)嚴(yán)重心律失常如心房纖顫和心室顫動，也可誘發(fā)扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(Tdp)，其中一個(gè)顯著特點(diǎn)是動作電位時(shí)程(APD)延長，這可能與心肌細(xì)胞離子通道發(fā)生病理性重構(gòu)有關(guān)。去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)作為重要的體內(nèi)心臟電生理和功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，在正常心肌電生理及病理狀態(tài)下心肌電重構(gòu)中都發(fā)揮重要作用。生理情況下，去甲腎上腺素介導(dǎo)交感神經(jīng)興

2、奮時(shí)對心臟的興奮作用，通過激動心肌細(xì)胞β1-腎上腺素能受體——腺苷酸環(huán)化酶(AC)——環(huán)磷酸腺苷（cAMP）途徑，通過第二信使PKA使L型鈣離子通道開放，鈣離子內(nèi)流增加，通過興奮——收縮偶聯(lián)增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮力。病理狀態(tài)下交感神經(jīng)過度興奮，心臟中去甲腎上腺素水平顯著增加，通過使多種離子通道發(fā)生重構(gòu)，使其功能異常，最終導(dǎo)致心臟電活動和收縮功能異常。已見報(bào)道的包括房顫和心衰發(fā)生時(shí)，交感神經(jīng)過度興奮導(dǎo)致NE異常增多引起心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP驟增可以

3、增大If，加快舒張期除極，細(xì)胞的自律性增高; NE激動α-腎上腺素能受體，使Ito密度減小，心肌動作電位時(shí)程延長;心肌細(xì)胞NE釋放增多，可顯著激活PKC，PKC會減小IK1，可能引起動作電位時(shí)程延長，自發(fā)除極發(fā)生概率增加，產(chǎn)生延遲后除極，以上離子通道發(fā)生重構(gòu)都可能誘發(fā)心律失常。正常生理情況，交感神經(jīng)興奮釋放NE，通過β1-腎上腺素能受體——PKA途徑可以增大慢激活延遲整流鉀電流(IKs)，但在NE長期過度刺激心肌致使心衰時(shí)IKs反而減小

4、，心臟復(fù)極儲備功能大大減弱，在心電圖上表現(xiàn)為QT間期延長，動作電位時(shí)程明顯延長?？傊琋E對多種離子通道都有調(diào)節(jié)作用，在生理和病理情況下對心臟的功能都有重要的影響。
　　AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）的重要生物活性肽。它可以維持心血管系統(tǒng)動態(tài)平衡，當(dāng)血壓突然降低時(shí)，可以迅速增高血壓。此外它與心肌梗死、心力衰竭和心肌肥厚等心臟疾病緊密聯(lián)系，是這些病理生理改變的中心環(huán)節(jié)。它可

5、以使心肌組織纖維積聚，損害心肌電傳導(dǎo)。已有研究表明，AngⅡ通過AT1受體延長L型鈣通道的激活和失活時(shí)間;在大鼠急性分離的心肌細(xì)胞，AngⅡ可以減小Ito電流密度，這與過表達(dá)人類基因AT1受體的轉(zhuǎn)基因小鼠上所得結(jié)果相同，這些都會使心肌復(fù)極化變緩，動作電位時(shí)程延長，最終導(dǎo)致心律失常?？梢夾ngⅡ?qū)π募〖?xì)胞多種離子通道都有調(diào)節(jié)作用，在心肌纖維化及心律失常方面具有重要作用。
　　慢激活延遲整流鉀電流(IKs)是心肌細(xì)胞復(fù)極化過程中重要的

6、鉀電流，由KCNQ1(KvLQT1)編碼的構(gòu)成孔區(qū)的α亞單位和KCNE1(Mink)編碼的β亞單位構(gòu)成。它是構(gòu)成心臟復(fù)極儲備功能的重要鉀離子通道。先天性缺陷、藥物作用和后天獲得性IKs缺失都會導(dǎo)致QT間期延長，復(fù)極過程減慢，動作電位時(shí)程延長。
　　在NE和AngⅡ所致的心肌肥厚和心衰的動物模型中觀察到IKs發(fā)生顯著變化，但NE和AngⅡ?qū)Ks的調(diào)節(jié)和信號通路的比較和差異尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在急性分離的豚鼠心室肌

7、細(xì)胞和心房肌細(xì)胞分別觀察NE和AngⅡ?qū)Ks的作用，并分析、比較兩者作用的細(xì)胞內(nèi)信號通路的異同。
　　第一部分、NE對豚鼠心肌細(xì)胞的慢激活延遲整流鉀電流（IKs）的作用
　　目的:觀察NE對豚鼠心室肌細(xì)胞和心房肌細(xì)胞IKs的作用。
　　方法:在急性分離的豚鼠心室肌細(xì)胞和心房肌細(xì)胞，采用吸破式全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄IKs電流，觀察NE對IKs的作用。
　　記錄IKs的細(xì)胞外液包括（in mM）:NaCl132，KC

8、l4，MgCl21.2，CaCl21.8，glucose5，Hepes10(pH7.4 with NaOH)。外液中加入Nimodipine（1μM）用于阻斷L-type Ca2+ current。IKr用5μM E-4031阻斷。電極內(nèi)液包括(in mM):potassium aspartate125, KCl20, MgCl21,Mg-ATP5,EGTA10，Hepes5(pH7.2 with KOH)。將細(xì)胞鉗制在-30 mV，從

9、-30 mV以階躍電壓10 mV的方式去極化至+70 mV,維持2s，然后電壓復(fù)極至-30mV，誘發(fā)IKs外向尾電流。
　　以上實(shí)驗(yàn)在室溫(20℃～25℃)條件下進(jìn)行。
　　結(jié)果:外液中加入NE（10μM）后，豚鼠心室肌細(xì)胞去極化外向電流和復(fù)極時(shí)的尾電流顯著增大，當(dāng)去極化電壓為+70 mV時(shí)，尾電流由給藥前的1.8±0.1 pA/pF增大到2.6±0.2 pA/pF(n=6)。增大作用在2-3 min達(dá)到穩(wěn)態(tài)，且電流可被IK

10、s特異性抑制劑Chromanol293B（293 B，30μM）完全抑制。NE濃度依賴性增大IKs，以IKs尾電流增大百分比為縱坐標(biāo)做出NE增大IKs的量效曲線，經(jīng)Hill方程擬合得到EC50=0.66±0.09μM。由尾電流制作使用NE前后IKs電流-電壓關(guān)系曲線并得到給藥前后V1/2分別為36.9±1.8 mV和35.7±2.4mV(n=6，P＞0.05)，NE不影響豚鼠心室肌細(xì)胞IKs通道電壓依賴性激活。
　　NE（10μM

11、）對豚鼠心房肌細(xì)胞IKs同樣有增大作用。NE增大IKs尾電流，當(dāng)電壓去極至+50 mV時(shí)，電流密度由0.65±0.10 pA/pF增大到0.95±0.10 pA/pF(n=5)，且電流可被IKs特異性抑制劑Chromanol293B（293 B，30μM）完全抑制。由尾電流制作使用NE前后IKs電流-電壓關(guān)系曲線并得到給藥前后V1/2分別為34.45±4.24 mV和33.05±5.86 mV(n=5，P＞0.05)，NE不影響豚鼠心房

12、肌細(xì)胞IKs通道電壓依賴性激活。
　　結(jié)論:NE增大豚鼠心室肌細(xì)胞和心房肌細(xì)胞的IKs電流，這種增大作用不影響通道的電壓門控特征。
　　第二部分、AngⅡ?qū)﹄嗍笮募〖?xì)胞的慢激活延遲整流鉀電流(IKs)的作用
　　目的:觀察AngⅡ?qū)﹄嗍笮氖壹〖?xì)胞和心房肌細(xì)胞IKs的作用。
　　方法:在急性分離的豚鼠心室肌細(xì)胞和心房肌細(xì)胞，采用吸破式全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄IKs電流，觀察AngⅡ?qū)Ks的作用。
　　結(jié)果:外液

13、中加入AngⅡ(100 nM)后，去極化外向電流和復(fù)極時(shí)的尾電流顯著減小，當(dāng)去極化電壓為+70 mV時(shí)，尾電流由給藥前的1.9±0.1pA/pF減小到1.4±0.01 pA/pF(n=6)。抑制作用2-3 min出現(xiàn)，5-10 min左右達(dá)到穩(wěn)態(tài)，沖洗后AngⅡ?qū)﹄娏鞯囊种谱饔貌荒芡耆謴?fù)。AngⅡ濃度依賴性抑制IKs，以IKs尾電流抑制百分比為縱坐標(biāo)做出AngⅡ減小IKs的量效曲線，經(jīng)Hill方程擬合得到IC50=30.42±5.97

14、 nM。由尾電流制作使用AngⅡ前后IKs電流-電壓關(guān)系曲線并得到給藥前后V1/2分別為33.3±0.8mV和31.6±1.9 mV(n=6，P＞0.05)，AngⅡ不影響心室肌IKs通道電壓依賴性激活。
　　AngⅡ(100 nM)同樣抑制豚鼠心房肌細(xì)胞IKs電流。AngⅡ減小IKs尾電流，當(dāng)電壓去極至+70 mV時(shí)，電流密度由1.76±0.12 pA/pF減小到1.29±0.08 pA/pF(n=5)，沖洗后AngⅡ?qū)﹄娏鞯囊?/p>

15、制作用不能完全恢復(fù)。由尾電流制作使用AngⅡ前后IKs電流-電壓關(guān)系曲線并得到給藥前后V1/2分別為37.94±1.19 mV和38.90±2.47 mV(n=6，P＞0.05)，AngⅡ不影響IKs通道電壓依賴性激活。
　　結(jié)論:AngⅡ抑制豚鼠心室肌細(xì)胞和心房肌細(xì)胞的IKs電流，這種抑制作用不影響通道的電壓門控特征。
　　第三部分、NE及AngⅡ調(diào)節(jié)豚鼠心肌細(xì)胞IKs功能的機(jī)制
　　目的:分別觀察NE和AngⅡ?qū)﹄?/p>

16、鼠心室肌細(xì)胞IKs調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞信號機(jī)制。
　　方法:在急性分離的豚鼠心室肌細(xì)胞上，采用吸破式全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄IKs電流，觀察PKA、PKC、PLC抑制劑對NE和AngⅡ?qū)Ks作用的影響。
　　結(jié)果:α1腎上腺素能受體阻斷劑prazosin（1μM）和doxazosin（1μM）可以部分阻斷NE增大IKs的作用，IKs增大作用幅度由42.3±1.9％分別降低至21.9±0.6％和26.1±0.1％。PLC抑制劑U731

17、22（1μM）和edelfosine（1μM）明顯減弱NE增大IKs的作用，IKs增大作用幅度由40.9±2.3％分別降低至21.0±0.4％和12.7±1.2％。PKC抑制劑Bis-1(100nM)也明顯減弱NE增大IKs的作用，IKs增大作用幅度由40.9±2.3％降低至22.6±0.6％。
　　低濃度α1腎上腺素能受體特異性激動劑phenylephrine(PE)（10μM）對豚鼠心室肌細(xì)胞IKs沒有明顯的增大作用。

18、　　高濃度α1腎上腺素能受體特異性激動劑phenylephrine(PE)(60μM)增大IKs百分比為24.4±0.8％。在β腎上腺素能受體阻斷劑propranolol(1μM)存在情況下，PE不再增大IKs，反而抑制IKs。
　　β腎上腺素能受體阻斷劑propranolol（1μM）幾乎完全阻斷NE增大IKs的作用，IKs增大作用幅度由40.9±2.3％降低至5.78±0.2％。PKA阻斷劑H89（30μM）也幾乎完全阻斷NE

19、增大IKs的作用，IKs增大作用幅度由40.9±2.3％降低至5.4±1.1％。
　　AT1受體阻斷劑Losartan（1μM）幾乎完全消除AngⅡ?qū)Ks電流的抑制作用。PLC抑制劑U73122（1μM）和edelfosine（1μM）明顯減弱AngⅡ抑制IKs的作用，IKs減小作用幅度由29.8±0.9％分別降低至15.2±2.7％和12.9±0.3％。PKC抑制劑Bis-1(100 nM)也明顯減弱AngⅡ抑制IKs的作用，