CCK-8對LPS誘導大鼠TASMCs的調節(jié)作用及其信號轉導機制探討.pdf

1、內毒素休克(endotoxic shock，ES)是臨床各科常見的危重病理過程，內毒素休克及其合并癥多器官功能障礙綜合癥是ICU患者最常見的死亡原因。在內毒素休克的發(fā)病早期，體循環(huán)血管舒張、平均動脈壓(meanarterial pressure，MAP)進行性降低是其特征性病理變化。內毒素的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及其誘導機體產(chǎn)生的促炎細胞因子可引起血管調控超氧化物岐化酶(superoxide di

2、smutase，SOD)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)的異常表達，氧自由基、一氧化氮(nitric oxide,NO)等生成增多，干擾血管的調節(jié)機制，可能是ES早期血壓降低的重要原因。 鑒于VSMC是血管的功能細胞，本課題在我室系列研究的基礎上，以體外培養(yǎng)的大鼠胸主動脈平滑肌細胞(thoracic aortic smooth musclecells，TASMCs)為

3、研究對象，擬觀察CCK-8對LPS誘導大鼠TASMCsiNOS和不同類型SOD表達的影響及其信號轉導機制，以及CCK-8對LPS誘導大鼠TASMCs 阿片受體表達的影響及其在受體水平的交互作用，以進一步探討CCK-8緩解ES大鼠血管功能障礙的分子機制。 1 CCK-8抑制LPS誘導大鼠TASMCs iNOS表達的受體機制研究1.1 CCK受體在大鼠TASMCs中的表達及LPS的影響 目的：為了探討CCK受體在大鼠TASM

4、Cs中的表達及不同劑量及不同時間LPS對CCK受體表達的影響。 方法：用貼塊法培養(yǎng)大鼠TASMCs，給予LPS(0.1mg/L)孵育細胞不同時間，采用RT-PCR及免疫細胞化學技術檢測CCK-AR和CCK-BR的基因和蛋白表達及LPS對其表達的影響。數(shù)據(jù)用x±S表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結論：在體外培養(yǎng)的大鼠TASMCs中存在著C

5、CK-AR和CCK-BRmRNA及蛋白的表達；LPS可誘導其表達上調。 本部分將主要觀察CCK-8對LPS誘導TASMCs iNOS表達及CCK-AR拮抗劑CR-1409和CCK-BR拮抗劑CR-2945對其的影響，以闡明CCK-8的抗休克作用機制。 方法：培養(yǎng)大鼠TASMCs，在加入或不加入CCK-8和/或CCK受體拮抗劑CR-1409/CR-2945 的情況下，給予LPS刺激細胞16h，用RT-PCR技術檢測細胞iN

6、OS mRNA的表達；Western blot技術檢測胞漿iNOS蛋白表達，以光密度值表示其相對含量。數(shù)據(jù)用x±S表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結論：LPS可增加TASMCs中iNOS mRNA及蛋白的表達；CCK-8抑制了LPS的這種作用； CCK-8的這種抑制作用是由其靶細胞膜上特異性受體介導的，且CCK-AR的作用略強于CCK-BR。

7、 2 CCK-8抑制LPS誘導的大鼠TASMCs SOD表達的信號轉導機制初探 2.1 PTK通路參與CCK-8對LPS誘導的大鼠TASMCs NF-kB活性的影響 目的：NF-kB是內毒素休克過程中重要的轉錄因子，蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)作為NF-kB的上游蛋白，介導細胞多種不同的信號轉導途徑。本部分主要研究CCK-8是否影響LPS誘導TASMCs中NF-kB活性變

8、化及PTK是否參與這一過程，以闡明CCK-8的抗休克信號轉導機制。 方法：培養(yǎng)大鼠TASMCs，在加入或不加入CCK-8和/或PTK特異性拮抗劑Genistein的情況下，用LPS刺激細胞一定時間，用電泳遷移率改變分析(EMSA)方法檢測細胞NF-kB活性變化；用Western blot技術分析細胞胞漿中IkB蛋白的表達水平；用免疫細胞化學分析技術觀測P65蛋白的核轉位。數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，用

9、ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結論：CCK-8可抑制LPS誘導的NF-kB活性增加，而PTK參與了這一過程，這可能是CCK-8抗內毒素休克作用的上游信號轉導機制之一。 2.2 CCK-8抑制LPS誘導的大鼠TASMCs SOD表達的信號轉導機制 目的：超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)是機體清除自由基的重要抗氧化酶，可清除超氧陰離子；而內毒

10、素休克的發(fā)病早期，體循環(huán)血管舒張、平均動脈壓進行性降低與氧自由基的生成增多密切相關。我們的研究表明，CCK-8具有一定的抗內毒素休克作用，可增強SOD的活性，翻轉LPS導致的SOD活性降低；抑制LPS誘導的Cu-ZnSOD及Mn SOD mRNA表達的增高。 本試驗第二部分(1)已證實CCK-8可抑制LPS誘導的NF-kB活性增加，且PTK參與了這一過程。然而，CCK-8抑制LPS誘導的大鼠TASMCs SOD表達的的信號轉導機

11、制尚未闡明。鑒于NF-kB是參與LPS誘導細胞產(chǎn)生自由基的重要轉錄因子，為進一步闡明CCK-8抗內毒素休克效應的分子機制，本部分內容主要觀察Gen作用于CCK-8和LPS共同孵育的TASMCs后，Cu-Zn SOD及Mn SOD mRNA表達的變化。 方法：培養(yǎng)大鼠TASMCs，在加入或不加入CCK-8和/或Genistein的情況下，用LPS刺激細胞一定時間，用半定量RT-PCR檢測SODmRNA表達。數(shù)據(jù)用x±S表示，用SP

12、SS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結論：CCK-8可抑制LPS誘導的Cu-Zn SOD及Mn SOD mRNA表達的增高，且PTK介導了這一過程，這可能是CCK-8抗內毒素休克作用的信號轉導機制之一。 本部分內容主要觀察PKC拮抗劑白屈菜赤堿(chelerythrine，CHE)、嗎啡作用于CCK-8和/或LPS孵育的 TASMCs后к阿片受體mRN

13、A表達變化，以闡明CCK-8調節(jié)LPS誘導大鼠 TASMCs к阿片受體表達的分子機制。 方法：培養(yǎng)大鼠。TASMCs，在加入或不加入CCK-8和/或CHE、嗎啡的情況下，用LPS刺激細胞16h，用半定量RT-PCR檢測к阿片受體mRNA的表達。數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結論：CCK-8可通過PKC抑制LPS誘導大鼠

14、TASMCs к阿片受體mRNA表達的增高，這可能是CCK-8抗內毒素休克作用的信號轉導機制之一。 小結 本研究從受體、轉錄因子、與ES相關因子的基因及蛋白表達多個層次比較系統(tǒng)地研究了CCK-8對LPS誘導 TASMCs的調節(jié)作用及其信號轉導機制，取得以下新發(fā)現(xiàn)： 1．CCK-AR和CCKoBR在大鼠 TASMCs 中均有表達；LPS可明顯誘導其表達上調，其中CCK-BR的相對表達量高于CCK-AR。 2

15、．CCK-8可劑量依賴性地抑制LPS引起大鼠TASMCs iNOS表達的增加，此作用是由其受體介導的。 3．CCK-8對LPS誘導大鼠TASMCs NF-кB的活化抑制作用，且PTK參與了此過程。 4．CCK-8可抑制LPS誘導大鼠TASMCs的Cu-ZnSOD、MnSOD mRNA表達，LPS-PTK-NF-kB-SOD通路可能是其信號轉導之一。 5．CCK-8可抑制LPS誘導大鼠 TASMCs 阿片受體基因表