食管鱗癌中RASSF5不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)及其表觀遺傳學(xué)失活機(jī)制的研究.pdf

1、目的:食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，我國是世界食管癌的高發(fā)國。中國北方地區(qū)尤其是沿太行山脈的河南河北等地是食管癌高發(fā)區(qū)之一，以食管鱗癌最常見。食管癌癥狀隱匿，就診時(shí)多處于中晚期，相當(dāng)部分的病人已不能手術(shù)治療，預(yù)后較差，因此提高食管癌早期診斷率和加強(qiáng)病因?qū)W研究以便進(jìn)行一級(jí)預(yù)防，十分必要。目前普遍認(rèn)為食管癌是多因素、多基因、多階段的復(fù)雜發(fā)生發(fā)展過程，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。
　　除DNA核苷酸序列改變可影響腫瘤發(fā)生發(fā)展外，表觀

2、遺傳學(xué)機(jī)制在腫瘤形成過程中的作用越來越受到重視。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因修飾途徑之一，是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，在維持正常細(xì)胞功能、胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生中起著重要作用。腫瘤相關(guān)基因DNA甲基化狀態(tài)的改變?cè)谀[瘤中普遍存在，DNA甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化造成的抑癌基因失活有關(guān)，因此抑癌基因是目前腫瘤甲基化研究的主要熱點(diǎn)。RASSF5（又名NORE1）是Ras相關(guān)

3、區(qū)域家族中的一個(gè)成員，是鼠類Ras受體Nore1的人類同系物，位于染色體1q32.1。由于選擇性剪接和不同的啟動(dòng)子使用，RASSF5包含三種不同的轉(zhuǎn)錄本，RASSF5A、RASSF5B和RASSF5C。它們的外顯子各不相同，RASSF5A包含外顯子1、2、4、5、6、7，RASSF5B包含外顯子1、2、4、5、7，RASSF5C包含外顯子3、4、5、6、7。不同的轉(zhuǎn)錄本在食管鱗癌中所起的作用可能不同。本研究通過檢測食管鱗癌組織中RASS

4、F5基因不同轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達(dá)，確定相應(yīng)表達(dá)轉(zhuǎn)錄本后再研究此轉(zhuǎn)錄本在食管癌細(xì)胞中的mRNA表達(dá)及其甲基化狀態(tài)，在食管鱗癌組織中的蛋白表達(dá)情況以及甲基化狀態(tài)，探討RASSF5基因不同轉(zhuǎn)錄本在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義。
　　方法:
　　1應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)技術(shù)分別檢測49例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中 RASS

5、F5基因不同轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達(dá)情況以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycitydine，5-aza-dC）處理前后的食管癌細(xì)胞系(TE1、TE13、T.Tn、Ec109)中RASSF5A的mRNA表達(dá)情況。
　　2應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)技術(shù)分別檢測應(yīng)用5-aza-dC處理前后的食管癌

6、細(xì)胞系和49例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中RASSF5A基因的甲基化狀態(tài)。
　　3應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry) SP法檢測49例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中RASSF5A蛋白的表達(dá)情況。
　　4運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1食管鱗狀上皮組織中RASSF5不同轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達(dá)
　　RASSF5A轉(zhuǎn)錄本是主要在食管鱗狀上皮中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本

7、，轉(zhuǎn)錄本RASSF5B和RASSF5C在食管鱗狀上皮中的表達(dá)均很低。
　　2食管癌細(xì)胞中RASSF5A的mRNA表達(dá)及甲基化狀態(tài)
　　2.15-aza-dC處理前后食管癌細(xì)胞系中RASSF5A的mRNA表達(dá)
　　四株未處理的食管癌細(xì)胞株中，TE1、Ec109細(xì)胞株中RASSF5A基因mRNA表達(dá)呈弱陽性，TE13、T.Tn細(xì)胞株中RASSF5A基因表達(dá)缺失，用甲基化抑制劑5-aza-dC處理后，TE1、Ec109細(xì)胞株

8、中RASSF5A基因表達(dá)增高，TE13、T.Tn細(xì)胞株中均檢測出RASSF5A mRNA的表達(dá)。
　　2.25-aza-dC處理前后食管癌細(xì)胞系中RASSF5A的甲基化狀態(tài)
　　四株未處理的食管癌細(xì)胞系中，TE1細(xì)胞中RASSF5A基因表現(xiàn)出不完全甲基化，其余三株細(xì)胞系中RASSF5A基因啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)，應(yīng)用甲基化抑制劑5-aza-dC處理后，TE1細(xì)胞株中RASSF5A基因甲基化程度降低，非甲基化程度增加，其余三種

9、細(xì)胞株中RASSF5A基因均表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。
　　3食管鱗癌組織中RASSF5A基因的表達(dá)、甲基化狀態(tài)及其與臨床病理資料之間的關(guān)系
　　3.1食管鱗癌組織中RASSF5A基因mRNA的表達(dá)
　　RASSF5A基因mRNA在食管鱗癌和癌旁正常組織的表達(dá)量分別為0.57±0.18和0.87±0.10，食管鱗癌組織中RASSF5A基因的mRNA表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-10.201，P=0

10、.000)。在食管鱗癌患者中，RASSF5A的mRNA表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及腫瘤組織的分期和分化程度有關(guān)（P＜0.05），而與患者的年齡和性別無關(guān)(P＞0.05)。
　　3.2食管鱗癌組織中RASSF5A基因蛋白的表達(dá)
　　49例食管鱗癌組織中，RASSF5A蛋白表達(dá)陽性率為26.5％(13/49)，49例正常食管黏膜組織中，RASSF5A蛋白表達(dá)陽性率為75.5％(37/49)，食管鱗癌組織中RASSF5A基因蛋白表

11、達(dá)陽性率顯著低于癌旁正常組織，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。在食管鱗癌中，RASSF5A蛋白表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和腫瘤組織的分化程度有關(guān)(P＜0.05)，而與年齡、性別以及腫瘤組織的分期無關(guān)（P＞0.05）。
　　3.3食管鱗癌組織中RASSF5A基因甲基化狀態(tài)
　　RASSF5A基因啟動(dòng)子區(qū)在食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的甲基化率分別55.1％(27/49)和28.6％(14/49)。食管鱗癌組織中RAS

12、SF5A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率顯著高于癌旁正常組織(P=0.011)。RASSF5A基因在食管鱗癌組織中的甲基化率與年齡、性別以及腫瘤組織分期無關(guān)（P＞0.05）。低分化鱗癌組RASSF5A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率75.9％(22/29)顯著高于高中分化鱗癌組甲基化發(fā)生率25.0％(5/20)(x2=12.377，P=0.000);RASSF5A基因啟動(dòng)子區(qū)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的甲基化發(fā)生率80.8％(21/26)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的甲基

13、化發(fā)生率26.1％(6/23)(x2=14.750，P=0.000)。
　　3.4 RASSF5A基因甲基化、mRNA和蛋白表達(dá)之間的關(guān)系
　　RASSF5A蛋白表達(dá)陽性的食管鱗癌組織中，其mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.68±0.17，RASSF5A蛋白表達(dá)陰性的食管鱗癌組織中，其mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.52±0.16，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.036，P=0.007）。在RASSF5A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性的食管鱗癌組織中

14、，其mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.51±0.16，甲基化陰性的食管鱗癌組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.64±0.17，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.737，P=0.009)。發(fā)生RASSF5A基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的食管鱗癌組織中RASSF5A蛋白表達(dá)陽性率為11.1％(3/27)，RASSF5A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陰性的食管鱗癌組織中RASSF5A蛋白表達(dá)陽性率為45.5％(10/22)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=7.335，P=0.007)

15、。RASSF5A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與其蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(R=-0.387，P=0.006)。
　　結(jié)論:
　　1食管鱗狀上皮組織中主要表達(dá)的RASSF5的轉(zhuǎn)錄本可能是RASSF5A。
　　2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC能夠逆轉(zhuǎn)RASSF5A基因的甲基化，使RASSF5A恢復(fù)表達(dá)，提示RASSF5A基因啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化可能是導(dǎo)致其在食管癌細(xì)胞中表達(dá)缺失的重要機(jī)制之一。
　　3食管鱗癌組織中RASSF5A