溶血磷脂酸受體在血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化和遷移中的作用研究.pdf

1、目的：
　　 血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型轉(zhuǎn)化是高血壓、動脈粥樣硬化和血管成型術(shù)后再狹窄等心血管病血管平滑肌細胞增殖和遷移的關(guān)鍵性起始步驟，是該類疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。而增殖的平滑肌細胞由血管中層向內(nèi)膜遷移是內(nèi)膜增厚一個重要機制。VSMC遷移的結(jié)果可導(dǎo)致內(nèi)膜中VSMC大量積聚和結(jié)締組織形成，進而促進新生內(nèi)膜形成及動脈粥樣硬化。溶血磷脂酸(Lysophosphatidic

2、 acid，LPA)是一種具有多種生物學(xué)作用的磷脂信使，其通過G蛋白藕聯(lián)受體(G-protein-coupledreceptors，GPCR)介導(dǎo)多種生物學(xué)功能。體外及活體實驗均充分證明不飽和LPA可以誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化，刺激VSMC遷移和增殖。但LPA通過哪個G蛋白藕聯(lián)受體介導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化和遷移尚不清楚。本研究旨在探討溶磷脂酸受體在LPA誘導(dǎo)的平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化和遷移中的作用及相關(guān)信號傳導(dǎo)通路。
　　 方法：
　　

3、 1．根據(jù)文獻建立分化表型VSMC培養(yǎng)體系，以不同濃度水平不飽和LPA(0-101μM)干預(yù)大鼠平滑肌細胞(rat aortic smooth muscle cells，RASMCs)，鏡下觀察細胞形態(tài)，興奮劑(乙酰膽堿)刺激引發(fā)的細胞收縮反應(yīng)并照相。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法和免疫印跡法(Western blot)分別檢測分化和去

4、分化RASMCs細胞表型標(biāo)志SMA-α和Osteopontin(OPN)基因及其蛋白的表達。
　　 2．RT-PCR法檢測LPA受體基因在分化及去分化表型RASMCs的表達。
　　 3．在LPA(1μM)刺激下以LPA受體1，3拮抗劑DGPP8：0，高選擇性LPA受體3激動劑OMPT以及百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)干預(yù)分化表型RASMCs。RT-PCR法和Western blot法分別檢測SMA-

5、α和OPN基因及其蛋白的表達，鏡下觀察細胞形態(tài)，興奮劑(乙酰膽堿)刺激引發(fā)的細胞收縮反應(yīng)并照相。Western blot法檢測p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)，磷酸化p38MAPK(P-p38 MAPK)，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，磷酸化ERK(P-ERK)蛋白水平。

6、>　　 4．貼壁法培養(yǎng)RASMCs，取第3-5代平滑肌細胞，進行實驗。應(yīng)用Boyden小室法檢測細胞遷移。RASMCs(1x105 cells)放置在Boyden小室上室，下室中含有(0-25μM)LPA，上下室中間放置8μm聚碳酸酯濾膜。細胞孵育6H后進行遷移。鏡下隨機選取4個視野(X400)，計數(shù)遷移到濾膜下層的細胞。
　　 5．在LPA(10μM)條件下，應(yīng)用不同劑量濃度DGPP8：0(0-50μM)和OMPT(0-50

7、μM)處理RASMC，應(yīng)用Boyden小室法檢測細胞遷移。
　　 6．(0-25μM)LPA預(yù)處理RASMCs，Western blot法檢測p38MAPK，P-P38，ERK，P-ERK蛋白水平。
　　 7．在LPA(10μM)條件下以DGPP8：0(50μM)，預(yù)處理RASMCs，Western blot法檢測p38 MAPK，P-p38 MAPK，ERK，P-ERK蛋白水平。以p38MAPK抑制劑：SB203580

8、(30μM)，ERK抑制劑：PD98059(30μM)，PTX(100 ng/ml)分別預(yù)處理RASMCs，Boyden小室法檢測細胞遷移。Western blot法檢測p38MAPK，P-p38MAPK，ERK，P-ERK蛋白水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．LPA以劑量依賴的方式共同激活p38MAPK和ERK，促使其磷酸化，并誘導(dǎo)RASMCs表型轉(zhuǎn)化。
　　 2．DGPP8：0可阻止LPA誘導(dǎo)的RASMC表型轉(zhuǎn)

9、化，不同劑量OMPT單獨作用RASMC，對其表型無任何影響。當(dāng)DGPP8：0和OMPT共同作用RASMC時，OMPT在1μM可幾乎完全拮抗DGPP8：0對RASMC表型轉(zhuǎn)化的阻滯作用。
　　 3．DGPP8：0可阻滯LPA誘導(dǎo)的p38MAPK和ERK磷酸化，OMPT可以誘導(dǎo)ERK磷酸化，但對于p38MAPK活性沒有影響。OMPT和DGPP8：0共同作用時可以消除DGPP8：0對p38MAPK和ERK磷酸化的拮抗作用。
　　

10、 4．PTX對于LPA誘導(dǎo)的RASMCs表型轉(zhuǎn)化沒有影響。
　　 5．LPA以劑量依賴的方式誘導(dǎo)RASMCs遷移。在10μM LPA時遷移細胞數(shù)量達到峰值，隨后下降。
　　 6．DGPP8：0在10μM可顯著抑制RASMCs遷移，在50μM幾乎可完全抑制遷移。小劑量DGPP8：0(0．1-1μM)以及各濃度OMPT(最高至50μM)對于LPA誘導(dǎo)的遷移幾乎沒有影響。
　　 7．LPA以劑量依賴的方式刺激p38M

11、APK和ERK磷酸化，在10μM達到峰值，隨后下降。DGPP8：0(50μM)可以完全阻滯p38MAPK和ERK磷酸化。
　　 8．SB203580(30μM)可以部分但是顯著的抑制遷移；PD98059(30μM)幾乎可完全抑制LPA誘導(dǎo)的ERK磷酸化，但不能阻止LPA誘導(dǎo)的遷移。當(dāng)SB203580和PD98059共同處理RASMCs時，SB203580對于RASMCs遷移的抑制作用并未得到加強。
　　 9．PTX可阻止

12、LPA誘導(dǎo)的p38MAPK和ERK磷酸化，幾乎可完全抑制LPA誘導(dǎo)的遷移。
　　 結(jié)論：
　　 1．LPA通過與Gq蛋白藕聯(lián)的LPA受體3介導(dǎo)了LPA誘導(dǎo)的RASMCs表型轉(zhuǎn)化
　　 2．LPA通過Gi蛋白藕聯(lián)的LPA受體1，主要經(jīng)由p38MAPK信號通路介導(dǎo)LPA誘導(dǎo)的RASMCs遷移。
　　 3．阻滯上述通路有可能成為控制與動脈粥樣硬化和再狹窄等血管疾病相關(guān)的VSMC表型轉(zhuǎn)化、遷移潛在的治療干預(yù)靶點。