MicroRNA-130a在血管平滑肌細(xì)胞增殖及血管重構(gòu)中的作用.pdf

1、第一章MicroRNA-130a在高血壓血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制
　　 研究背景：
　　 高血壓是我國(guó)的常見病、高發(fā)病，也是主要死因之一。長(zhǎng)期高血壓引發(fā)血管重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致心腦血管并發(fā)癥，后者是引起高血壓病人死亡的直接原因。血管重構(gòu)是高血壓病發(fā)生發(fā)展過程中最重要的病理因素，防治高血壓血管重構(gòu)是高血壓病治療的重要目標(biāo)。
　　 血管平滑肌細(xì)胞增殖是血管重構(gòu)時(shí)中膜增厚的主要原因，也是引起血管重構(gòu)的重要因素。已知多種生物活性

2、物質(zhì)可以調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的功能，一氧化氮(NO)、血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ），血小板源性生長(zhǎng)因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Endothelial growth factor，VEGF）等。新近研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs也參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的功能。
　　 文獻(xiàn)報(bào)道，Gax(Growth arrest-specific homeobo

3、x)是miR-130a的靶點(diǎn)之一，其主要表達(dá)在心血管系統(tǒng)，具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖、分化及遷移的作用。當(dāng)血管平滑肌細(xì)胞受到PDGF、AngⅡ、低氧等促增值因素刺激后，Gax表達(dá)下降。在多種血管疾病中，如球囊損傷血管，肺動(dòng)脈高壓，Alzheimer病的腦血管病變等，Gax表達(dá)下調(diào)；而過表達(dá)Gax可減輕上述血管損傷的程度。因此，我們推測(cè)miR-130a可能通過抑制Gax而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖并參與高血壓血管重構(gòu)。
　　 方法：

4、>　　 體外實(shí)驗(yàn)：大鼠原代主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)采用組織貼塊法制備。過表達(dá)miR-130a使用Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑將miR-130a模擬物(mimic)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入VSMCs。細(xì)胞增殖采用BrdU法。miR-130a及Gax的測(cè)定使用定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR法（Syber green法），Gax的蛋白水平測(cè)定采用Westem blot法。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：高血壓模型使用自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，WKY大鼠作為對(duì)照，選擇

5、26周齡雄性大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前兩天采用尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)測(cè)壓法測(cè)定外周收縮壓(SBP)。收集大鼠血漿放射免疫法測(cè)定血漿血管緊張素Ⅱ水平；取大鼠胸主動(dòng)脈，分為三段，上段用于提RNA，中段用于形態(tài)學(xué)分析，下段用于Westem。開腹腔分離腸系膜上動(dòng)脈，近心端0.5 cm用于形態(tài)學(xué)分析，其余用于提取RNA。形態(tài)學(xué)分析樣本甲醛固定，石蠟包埋，做蘇木精．伊紅（HE）染色。
　　 結(jié)果：
　　 25和50 nmol/L的miR-130a m

6、imic可顯著促進(jìn)VSMCs增殖，同時(shí)Gax的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)。用血管緊張素Ⅱ處理VSMCs后，miR-130a的表達(dá)呈時(shí)間(1、3、6、12、24 h)及劑量(10-10～10-6mol/L)依賴性升高，而Gax的表達(dá)呈時(shí)間及劑量依賴性下降。使用100、200 nmol/L的miR-130a抑制劑可部分抑制AngⅡ?qū)SMCs的增殖作用。
　　 SHR大鼠較WKY大鼠：(1)血壓顯著增高；(2)血漿血管緊張素Ⅱ

7、水平升高；(3)胸主動(dòng)脈及腸系膜上動(dòng)脈血管顯著增厚；(4)胸主動(dòng)脈及腸系膜上動(dòng)脈miR-130a的表達(dá)升高，Gax的表達(dá)下降。
　　 結(jié)論：
　　 Mir-130a通過抑制Gax而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，并參與高血壓血管重構(gòu)的形成
　　 第二章MicroRNA．130a在肺動(dòng)脈高壓血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制
　　 研究背景：
　　 肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary arterial hypertensi

8、on，PAH)是肺循環(huán)高血壓（Pulmonary hypertension）中的一類，是指肺動(dòng)脈血壓增高而肺靜脈壓力正常，主要特征是肺血管阻力進(jìn)行性升高，最終導(dǎo)致患者右心衰竭而死亡。
　　 PAH預(yù)后較差，且缺乏有效的治療手段。其病因涉及環(huán)境與遺傳因素，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。PAH時(shí)肺血管阻力進(jìn)行性升高的原因是血管重構(gòu)引起血管狹窄。肺血管重構(gòu)的發(fā)生牽涉到多種因子（通路），如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth

9、 factor beta, TGFp）、5．羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）、內(nèi)皮素(Endothelin，ET-1)、一氧化氮(NO)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（Fibroblast growth factor2，F(xiàn)GF2）等。近期研究表明，miRNA在PAH肺血管重構(gòu)發(fā)生過程中也發(fā)揮重要作用。
　　 文獻(xiàn)報(bào)

10、道，miR-130a不僅介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及血管形成，還參與心肌發(fā)育，更重要的是我們前期研究證明，miR-130a通過抑制Gax（Growth arrest-specific homeobox）可促進(jìn)主動(dòng)脈平滑肌增殖，其在高血壓重構(gòu)血管中表達(dá)升高。然而，miR-130a在肺動(dòng)脈高壓中的作用尚不清楚。既往報(bào)道，PAH肺組織中miR-130a的靶基因-Gax表達(dá)降低，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞低氧處理后，Gax亦下調(diào)。這些研究提示，miR-

11、130a-Gax通路可能也參與PAH肺動(dòng)脈平滑肌增殖及肺血管重構(gòu)。
　　 方法：
　　 1．采用低氧誘導(dǎo)和野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的兩種PAH大鼠模型。180～200g SD大鼠，低氧模型在10％O2的低氧倉(cāng)內(nèi)飼養(yǎng)3周；MCT模型在皮下注射2% MCT60 mg/kg后飼養(yǎng)3周。插管法測(cè)定右心室壓、肺動(dòng)脈壓及主動(dòng)脈壓。肺動(dòng)脈提RNA或蛋白，Gax及Ddx6蛋白檢測(cè)使用Westem blot。肺組織甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行H

12、E染色或Gax免疫組化。
　　 2．大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)采用組織貼塊法制備。細(xì)胞低氧刺激采用3%O22%血清。過表達(dá)miR-130a使用TurboFectsiRNA轉(zhuǎn)染試劑將miR-130a模擬物(mimic)瞬時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞。低表達(dá)miR-130a和Ddx6分別使用miR-130a抑制劑(lnhibitor)和siRNA。細(xì)胞增殖采用BrdU法。miR-130a及mRNA測(cè)定使用定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR法（Syber g

13、reen法），Ddx6蛋白檢測(cè)采用Westem blot法。
　　 3．熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建及檢測(cè)：將大約200 bp包含miR-130a結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)靶基因的3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslatedregion，3'-UTR)克隆入pGL3-Control熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。將帶有目的片段的報(bào)告基因質(zhì)粒、pRL-SV40內(nèi)參質(zhì)粒及miR-130a共轉(zhuǎn)染入人平滑肌細(xì)胞株，24h后檢測(cè)螢光素酶活性。
　　 結(jié)果

14、：
　　 1．低氧及MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠右心室壓及肺動(dòng)脈壓較正常對(duì)照組明顯升高；肺動(dòng)脈顯著增厚。PAH肺動(dòng)脈組織中miR-130a和Gax的表達(dá)均上調(diào)，pri-miR-130a的表達(dá)不變。免疫組化顯示Gax主要表達(dá)在肺血管。
　　 2．低氧處理PASMCs可引起細(xì)胞增殖，同時(shí)miR-130a表達(dá)呈時(shí)間依賴性升高，pri-miR-130a的表達(dá)不變。使用miR-130a抑制劑可以取消低氧引起的促增殖作用。
　　

15、3．過表達(dá)miR-130a可直接促進(jìn)PASMCs增殖，同時(shí)對(duì)平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物-SMA的表達(dá)沒有影響。
　　 4．miR-130a的靶基因Ddx6在PAH肺動(dòng)脈組織中表達(dá)降低。PASMCs中過表達(dá)miR-130a可以抑制Ddx6的表達(dá)。抑制Ddx6可促進(jìn)PASMCs增殖。
　　 5．預(yù)測(cè)BMPR2(Bone morphogenetic protein receptor, typeⅡ)、SMAD5(SMAD family

16、 member5)和ACVRI(Activin A receptor, typeⅠ)是miR-130a的靶點(diǎn)。構(gòu)建了這三個(gè)靶基因．螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，但是miR-130a對(duì)含有預(yù)測(cè)靶基因的螢光素酶的活性沒有影響。
　　 結(jié)論：
　　 1．miR-130a具有促PASMCs增殖作用，并介導(dǎo)PAH肺血管重構(gòu)形成，其機(jī)制是通過抑制Ddx6表達(dá)。
　　 2．Ddx6對(duì)PASMCs增殖具有抑制性調(diào)節(jié)作用，Ddx6下調(diào)可引