肺炎支原體p1基因分型與變異的研究.pdf

1、目的：檢測(cè)上海市從兒童呼吸道感染患者中分離的134例肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae, Mp）臨床分離株的基因型，分析p1基因RepMP4和RepMP2/3多態(tài)區(qū)的變異情況，為了解我國(guó)上海Mp的流行情況及免疫逃避機(jī)制、確定p1基因的保守序列，以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)Mp診斷試劑盒和制備Mp疫苗控制其感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：對(duì)上海市復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院2005~2009年分離的134株Mp臨床株用支原體肉湯培養(yǎng)基（C

2、M403）進(jìn)行復(fù)蘇傳代后，用支原體瓊脂培養(yǎng)基（CM401）進(jìn)行單個(gè)菌落培養(yǎng)，再用PCR進(jìn)一步鑒定。然后通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）、巢式PCR（nested polymerase chain reaction,nPCR）和快速循環(huán)PCR（rapid-cycle polym

3、erase chain reaction, Rapid-Cycle PCR）對(duì)134株Mp臨床分離株進(jìn)行MpⅠ、MpⅡ的基因分型，并比較這3種方法在基因分型中的作用；設(shè)計(jì)特異性引物，PCR分別擴(kuò)增Mp p1基因的多態(tài)區(qū) RepMP4和RepMP2/3區(qū)，通過(guò)RFLP、變性梯度凝膠電泳技術(shù)（Denaturing Gradient Gel ElectroPhoresis, DGGE）和基因測(cè)序分析p1基因變異情況，并比較PCR-RFLP、P

4、CR-DGGE法在檢測(cè)基因變異的作用。
　　結(jié)果：基因分型結(jié)果顯示：134例Mp臨床標(biāo)本中，nPCR法分型發(fā)現(xiàn)各Mp標(biāo)準(zhǔn)株、臨床株均同時(shí)擴(kuò)增出MpⅠ、Ⅱ型目的片段；Rapid-Cycle PCR法檢出MpⅠ型117例(87.31％)，MpⅡ型12例(8.96%)，5例均未有MpⅠ、Ⅱ型別結(jié)果顯示（3.73%）；PCR-RFLP法檢出MpⅠ型122例(91.04%)，MpⅡ型12例(8.96%)；134例Mp臨床株中，PCR-RFL

5、P檢測(cè)出14例臨床突變株；PCR-DGGE和基因測(cè)序這兩種方法除檢測(cè)出PCR-RFLP法所檢測(cè)出來(lái)的14株外，還發(fā)現(xiàn)4株臨床突變株。在這18例臨床突變株中，我們發(fā)現(xiàn)菌株Mp05、Mp21、Mp26、Mp53、Mp56、Mp61、Mp99、Mp132共8株為MpⅡ型V2c突變株；菌株Mp22、Mp34共2株為MpⅡ型V2a突變株；Mp3、Mp10、Mp16、Mp54、Mp59、Mp96、Mp126、共7株MpⅠ型發(fā)生了點(diǎn)突變。在所有突變株

6、中，Ⅰ型突變株7例（占Ⅰ型Mp的5.73%），Ⅱ型突變株11例（占Ⅱ型Mp的91.7%）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了一株新型V2型突變株Mp100，其p1基因的序列均不同于Ⅰ、Ⅱ型，與目前報(bào)道過(guò)亞型和突變型相比也均有很大的差異，但其p1基因RepMP4區(qū)最接近309（V2a），RepMP2/3區(qū)域中有142bp（2772~2913）序列與已報(bào)道過(guò)的p1基因變異情況均不相同，其完全同源重組了一段Mp基因座上p1基因以外的RepMP2/3-J序列（