肺炎支原體的檢測(cè)和分型及耐藥基因突變位點(diǎn)分析.pdf

1、目的:從呼吸道感染的兒童患者中檢測(cè)肺炎支原體( Mycoplasma pneumoniae, Mp),比較國(guó)內(nèi)外檢測(cè)Mp的主要方法,探討兒童感染Mp的早期診斷。同時(shí)了解Mp臨床株中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因23S rRNA、核糖體蛋白L4和L22的突變情況,并采用PCR-RELP、套式PCR(Nested polymerase chain reaction, nPCR)和快速循環(huán)PCR(Rapid-Cycle polymerase chain

2、reaction, Rapid-Cycle PCR)對(duì)Mp臨床株的基因進(jìn)行分型,比較三種應(yīng)用于Mp分型的分子生物學(xué)方法的特點(diǎn),以及在快速診斷、耐藥監(jiān)測(cè)和基因分型中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:采集患有肺炎或有咳嗽、發(fā)熱癥狀的呼吸道感染兒童的血清標(biāo)本、咽拭子及肺泡灌洗液標(biāo)本566份。采用特異性免疫凝集方法檢測(cè)支原體特異性IgM抗體(Antibodies, Ab),并提取566份疑似Mp感染患兒咽拭子及肺泡灌洗液標(biāo)本中的DNA,分別采用PC

3、R和實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR(A quantitative real-time PCR, Real-Time PCR)檢測(cè)標(biāo)本中的Mp-DNA,并比較這兩種分子生物學(xué)檢測(cè)法與血清抗體檢測(cè)方法對(duì)Mp感染患兒的檢出情況。將臨床咽拭子和肺泡灌洗液標(biāo)本200例分別接種到支原體快速鑒定培養(yǎng)液與常規(guī)SP4液體培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),獲取陽(yáng)性臨床株。同時(shí)設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增Mp23S rRNA基因II區(qū)和V區(qū)、核糖體蛋白基因L4和L22,觀察其突變情況

4、。最后采用PCR-RFLP、nPCR分型分析以及Rapid-Cycle PCR對(duì)臨床株的基因進(jìn)行分型,觀察這3種方法在基因分型中的特點(diǎn)。
　　結(jié)果:566份受檢患兒的血清標(biāo)本中,Mp-IgM陽(yáng)性285例(50.35％)。566份受檢患兒咽拭子及肺泡灌洗液標(biāo)本中(咽拭子508份,肺泡灌洗液58份),PCR法檢測(cè)出Mp-DNA陽(yáng)性45例(7.95%)。其中Mp-DNA陽(yáng)性,血清Mp-IgM陰性20例(7.11%)。Real-Time

5、PCR法檢測(cè)出 Mp-DNA陽(yáng)性(定量結(jié)果≥1.00e+005copies/ml)175例(30.91%),其中 Mp-DNA陽(yáng)性,Mp-IgM陰性67例(38.28%)。200例快速培養(yǎng)和常規(guī)SP4培養(yǎng)法分離培養(yǎng)咽拭子及肺泡灌洗液標(biāo)本中,快速培養(yǎng)法培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本35例(31.53%),經(jīng)PCR及Real-Time PCR鑒定陽(yáng)性標(biāo)本3例(2.70%),假陽(yáng)性32例(91.42%),經(jīng)菌落培養(yǎng)鑒定為真菌占假陽(yáng)性的93.75%(30/32)

6、。常規(guī)SP4分離培養(yǎng)法培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本6例(4.95%),經(jīng)菌落、PCR及Real-Time PCR鑒定結(jié)果一致率100%。其中咽拭子標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性4例,肺泡灌洗液標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性2例。24例Mp鑒定陽(yáng)性臨床株均存在23S rRNA耐藥基因的堿基突變,14例(58.33%)存在核糖體蛋白L22堿基突變,6例(25%)存在核糖體蛋白L4堿基突變。其中,Mp23S rRNA基因V區(qū)A2063G突變的臨床株16例(66.66%),其次是II區(qū)640位點(diǎn)

7、A缺失14例(58.33%)、V區(qū)2471位點(diǎn)C缺失10例(41.66%)、II區(qū)G759A突變8例(33.33%)。另外,Mp23S rRNA基因中還存在A649 T突變、G2661C突變、A2635C突變、1957 A缺失、1974A缺失、1966 C缺失、2783 T插入等多個(gè)位點(diǎn)的突變、缺失和插入。Mp核糖體蛋白L4中,C162A、A430G突變的臨床株4例(16.66%),一例C456T突變、一例 A209T突變。Mp核糖體蛋

8、白 L22中,498或499插入 A的臨床株11例(45.83%),其次是 T279C突變3例(12.5%)?；蚍中徒Y(jié)果顯示,45例 Mp鑒定陽(yáng)性臨床株中,MpⅠ型21例(46.66%),MpⅡ型24例(53.33%)。Rapid-Cycle PCR分型分析與RFLP-PCR和nPCR相比,可以更快速更有效的對(duì)Mp-DNA陽(yáng)性株進(jìn)行分型。
　　結(jié)論:
　　1)實(shí)時(shí)TaqMan Real-timePCR技術(shù)彌補(bǔ)了血清學(xué)方法與