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文檔簡介
1、本課題篩選了高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌種,并研究黑曲霉的發(fā)酵特性和酶學(xué)特性,優(yōu)化了β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮的最佳條件,對β-葡萄糖苷酶基因進行了克隆和序列分析;并以艾維茵肉用公雛為試驗對象,研究了β-葡萄糖苷酶對肉公雞生長、大豆異黃酮的吸收代謝、肉質(zhì)、脂肪代謝、抗氧化能力及激素水平的影響,從而揭示了β-葡萄糖苷酶的促生長機理。
1.菌種篩選和鑒定
從自然界篩選的6個菌種進行發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的研究,結(jié)果表明
2、,zju2的固體發(fā)酵和液體發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性均最高,說明zju2最適合用于發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶;對zju2的基因組進行提取,采用真菌通用引物對菌種18SrDNA進行PCR擴增及產(chǎn)物克隆,并進行序列分析,序列用BLAST程序和GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比較分析,結(jié)果表明該菌種與黑曲霉(Aspergillusniger D63697)同源性高達99%,進化樹距離最近,綜合菌落形態(tài)和產(chǎn)孢子性能,該菌種被鑒定為黑曲霉,命名為黑曲霉z
3、ju2(A.nigerzju2)。
2.黑曲霉zju2發(fā)酵特性研究
本試驗以黑曲霉zju2為出發(fā)菌株,對其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳固體培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,以麩皮為主要培養(yǎng)基,玉米芯粉比率20%以下或米糠比率10%以下,適合黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶,單獨使用麩皮為固體培養(yǎng)基更適宜黑曲霉生長;黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶不需添加碳源;添加2%的無機氮(硫酸銨、硝酸銨、氯化銨和尿素),均可提高酶活性,添加量高
4、于2%時,顯著降低β-葡萄糖苷酶活性;分別添加2-6%蛋白胨、4%酵母提取物、2%豆粕和4%棉籽粕,β-葡萄糖苷酶活性顯著提高。培養(yǎng)基含水量為70%、接種量為107cfu/g培養(yǎng)基、培養(yǎng)基pH6.0、發(fā)酵溫度28℃和培養(yǎng)時間72h為黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最優(yōu)條件,優(yōu)化后酶活高達508U/g。
3.黑曲霉zju2 B-葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性研究
采用酶學(xué)研究方法,通過硫酸銨沉淀、SephadexG-25脫鹽和S
5、ephadexG-100純化了β-葡萄糖苷酶,并進行了黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及米氏常數(shù)等特性研究;采用SDS-PAGE凝膠電泳測定了分子量。研究表明,β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為70℃、最適反應(yīng)pH為4.5;在40℃、50℃和60℃下較穩(wěn)定,80℃以上穩(wěn)定性差;β-葡萄糖苷酶在pH為3、7、8、9的緩沖液中的穩(wěn)定性很差,在pH為4、5、6的緩沖液中穩(wěn)定性較好,其中在pH為5時,穩(wěn)定性最好;酶
6、的Km=41.67mM,Vmax=23.81U/L;其分子量為65.2kDa。
4.黑曲霉zju2β-葡萄糖苷酶體外酶解效率研究
選用含量40%的大豆異黃酮(結(jié)合型占86.33%)和黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶為研究對象,以水解時間、溫度和酶量為試驗因素,以酶解產(chǎn)物游離型苷元含量為判斷標準,采用三因素五水平二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方案進行研究。結(jié)果表明:在游離型苷元含量(y)與反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度與酶量之間可建立數(shù)學(xué)
7、模型:0.876+0.029 X1-0.071 X2+0.072 X3-0.048X1X2+0.015 X1X3+0.017X2X3-0.035 X12-0.074 X22-0.091 X32,模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.86,達極顯著水平,模型有效;在本試驗所選水平范圍內(nèi),對水解率的影響程度大小依次為:酶量>溫度>時間。通過優(yōu)化,黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮的最佳反應(yīng)參數(shù)為時間5.3h,溫度55.4℃,酶量68.7 U/g。
8、 5.黑曲霉zju2β-葡萄糖苷酶基因克隆及序列分析
試驗采用Trizol法提取總RNA,以反轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板進行PCR擴增,并進行序列測定及結(jié)構(gòu)預(yù)測。研究表明,黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因全長2583bp,編碼860個氨基酸,理論分子量為93.2kDa,理論等電點為4.45。結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,β-葡萄糖苷酶信號肽切割位點在第19個氨基酸和第20個氨基酸之間,β-葡萄糖苷酶成熟肽片段為841個氨基酸,理論分子量為91.2
9、kDa;成熟肽中含有15個潛在的糖基化位點;二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,該蛋白中含無規(guī)卷曲568個,占67.54%,α-螺旋為155個,占19.62%,含折疊108個,占12.84%;該酶與蛋白質(zhì)庫中l(wèi)exl具有相似的三維構(gòu)象,同源性為23.7%。
6.β-葡萄糖苷酶對肉公雞生產(chǎn)性能的影響及機理研究
選用1日齡的艾維茵肉用公雛為試驗對象,設(shè)對照組和添加0.2%(0.6U/g飼糧)、0.4%(1.2U/g飼糧)及0.6%
10、(1.8U/g飼糧)酶制劑的試驗組,每組設(shè)4個重復(fù),每個重復(fù)15羽,研究該酶對肉公雞生長的影響并探討其作用機理。試驗表明:(1)β-葡萄糖苷酶能改善生產(chǎn)性能:飼糧中添加0.2%(0.6U/g飼糧)的β-葡萄糖苷酶使肉雞日增重顯著提高了8.26%(p<0.05),添加0.2%、0.4%和0.6%β-葡萄糖苷酶分別使料重比降低了5.8%(p<0.01)、2.68%(p<0.01)和2.23%(p<0.05)。(2)飼糧中添加0.2%β-葡萄
11、糖苷酶能提高大豆異黃酮的利用率:β-葡萄糖苷酶對大豆異黃酮的吸收和代謝有顯著的影響,使肉雞血清中結(jié)合型大豆異黃酮降低了68.02%。(3)飼糧中添加0.2%β-葡萄糖苷酶能改善肉質(zhì):使肉公雞滴水損失率降低了22.00%(p<0.05),胸肌L*值降低了11.17%(p<0.01),胸肌a*值提高了41.81%(p 12、%(p 13、血清指標鈣、磷和堿性磷酸酶也無顯著變化。(6)飼糧中添加0.2%β-葡萄糖苷酶對脂肪代謝某些指標產(chǎn)生影響:β-葡萄糖苷酶對肉雞的腹脂沉積、肌肉之間的脂肪沉積和尾部脂肪沉積都無顯著影響,β-葡萄糖苷酶對肉雞脂肪組織中HSL和LPL的活性均無顯著影響;β-葡萄糖苷酶對肉公雞甘油三酯、游離脂肪酸和總膽固醇沒有顯著影響,高密度脂蛋白膽固醇顯著提高了15.10%(p<0.05),低密度脂蛋白膽固醇降低了36.43%(p 14、糖苷酶提高肉雞的抗氧化能力:顯著提高了肉雞血清中超氧化物歧化酶的活性提高了16.45%(p<0.05),而使丙二醛的含量降低18.16%(p<0.05),肝臟中谷胱苷肽過氧化物酶和谷胱苷肽還原酶活性分別提高了33.00%(p
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