高效水解大豆異黃酮β-葡萄糖苷酶及其對(duì)肉公雞生產(chǎn)性能的影響研究.pdf

1、本課題篩選了高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌種，并研究黑曲霉的發(fā)酵特性和酶學(xué)特性，優(yōu)化了β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮的最佳條件，對(duì)β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行了克隆和序列分析；并以艾維茵肉用公雛為試驗(yàn)對(duì)象，研究了β-葡萄糖苷酶對(duì)肉公雞生長(zhǎng)、大豆異黃酮的吸收代謝、肉質(zhì)、脂肪代謝、抗氧化能力及激素水平的影響，從而揭示了β-葡萄糖苷酶的促生長(zhǎng)機(jī)理。
　　 1.菌種篩選和鑒定
　　 從自然界篩選的6個(gè)菌種進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的研究，結(jié)果表明

2、，zju2的固體發(fā)酵和液體發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性均最高，說(shuō)明zju2最適合用于發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶；對(duì)zju2的基因組進(jìn)行提取，采用真菌通用引物對(duì)菌種18SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物克隆，并進(jìn)行序列分析，序列用BLAST程序和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果表明該菌種與黑曲霉（Aspergillusniger D63697）同源性高達(dá)99％，進(jìn)化樹(shù)距離最近，綜合菌落形態(tài)和產(chǎn)孢子性能，該菌種被鑒定為黑曲霉，命名為黑曲霉z

3、ju2（A.nigerzju2）。
　　 2.黑曲霉zju2發(fā)酵特性研究
　　 本試驗(yàn)以黑曲霉zju2為出發(fā)菌株，對(duì)其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳固體培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，以麩皮為主要培養(yǎng)基，玉米芯粉比率20％以下或米糠比率10％以下，適合黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，單獨(dú)使用麩皮為固體培養(yǎng)基更適宜黑曲霉生長(zhǎng)；黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶不需添加碳源；添加2％的無(wú)機(jī)氮（硫酸銨、硝酸銨、氯化銨和尿素），均可提高酶活性，添加量高

4、于2％時(shí)，顯著降低β-葡萄糖苷酶活性；分別添加2-6％蛋白胨、4％酵母提取物、2％豆粕和4％棉籽粕，β-葡萄糖苷酶活性顯著提高。培養(yǎng)基含水量為70％、接種量為107cfu/g培養(yǎng)基、培養(yǎng)基pH6.0、發(fā)酵溫度28℃和培養(yǎng)時(shí)間72h為黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最優(yōu)條件，優(yōu)化后酶活高達(dá)508U/g。
　　 3.黑曲霉zju2 B-葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性研究
　　 采用酶學(xué)研究方法，通過(guò)硫酸銨沉淀、SephadexG-25脫鹽和S

5、ephadexG-100純化了β-葡萄糖苷酶，并進(jìn)行了黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及米氏常數(shù)等特性研究；采用SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定了分子量。研究表明，β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為70℃、最適反應(yīng)pH為4.5；在40℃、50℃和60℃下較穩(wěn)定，80℃以上穩(wěn)定性差；β-葡萄糖苷酶在pH為3、7、8、9的緩沖液中的穩(wěn)定性很差，在pH為4、5、6的緩沖液中穩(wěn)定性較好，其中在pH為5時(shí)，穩(wěn)定性最好；酶

6、的Km=41.67mM，Vmax=23.81U/L;其分子量為65.2kDa。
　　 4.黑曲霉zju2β-葡萄糖苷酶體外酶解效率研究
　　 選用含量40％的大豆異黃酮（結(jié)合型占86.33％）和黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶為研究對(duì)象，以水解時(shí)間、溫度和酶量為試驗(yàn)因素，以酶解產(chǎn)物游離型苷元含量為判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用三因素五水平二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在游離型苷元含量（y）與反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度與酶量之間可建立數(shù)學(xué)

7、模型：0.876+0.029 X1-0.071 X2+0.072 X3-0.048X1X2+0.015 X1X3+0.017X2X3-0.035 X12-0.074 X22-0.091 X32，模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.86，達(dá)極顯著水平，模型有效；在本試驗(yàn)所選水平范圍內(nèi)，對(duì)水解率的影響程度大小依次為：酶量>溫度>時(shí)間。通過(guò)優(yōu)化，黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮的最佳反應(yīng)參數(shù)為時(shí)間5.3h，溫度55.4℃，酶量68.7 U/g。
　

8、　 5.黑曲霉zju2β-葡萄糖苷酶基因克隆及序列分析
　　 試驗(yàn)采用Trizol法提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行序列測(cè)定及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。研究表明，黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因全長(zhǎng)2583bp，編碼860個(gè)氨基酸，理論分子量為93.2kDa，理論等電點(diǎn)為4.45。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，β-葡萄糖苷酶信號(hào)肽切割位點(diǎn)在第19個(gè)氨基酸和第20個(gè)氨基酸之間，β-葡萄糖苷酶成熟肽片段為841個(gè)氨基酸，理論分子量為91.2

9、kDa;成熟肽中含有15個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，該蛋白中含無(wú)規(guī)卷曲568個(gè)，占67.54％，α-螺旋為155個(gè)，占19.62％，含折疊108個(gè)，占12.84％;該酶與蛋白質(zhì)庫(kù)中l(wèi)exl具有相似的三維構(gòu)象，同源性為23.7％。
　　 6.β-葡萄糖苷酶對(duì)肉公雞生產(chǎn)性能的影響及機(jī)理研究
　　 選用1日齡的艾維茵肉用公雛為試驗(yàn)對(duì)象，設(shè)對(duì)照組和添加0.2％（0.6U/g飼糧）、0.4％（1.2U/g飼糧）及0.6％

10、（1.8U/g飼糧）酶制劑的試驗(yàn)組，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15羽，研究該酶對(duì)肉公雞生長(zhǎng)的影響并探討其作用機(jī)理。試驗(yàn)表明：（1）β-葡萄糖苷酶能改善生產(chǎn)性能：飼糧中添加0.2％（0.6U/g飼糧）的β-葡萄糖苷酶使肉雞日增重顯著提高了8.26％（p<0.05），添加0.2％、0.4％和0.6％β-葡萄糖苷酶分別使料重比降低了5.8％（p<0.01）、2.68％（p<0.01）和2.23％（p<0.05）。（2）飼糧中添加0.2％β-葡萄

11、糖苷酶能提高大豆異黃酮的利用率：β-葡萄糖苷酶對(duì)大豆異黃酮的吸收和代謝有顯著的影響，使肉雞血清中結(jié)合型大豆異黃酮降低了68.02％。（3）飼糧中添加0.2％β-葡萄糖苷酶能改善肉質(zhì)：使肉公雞滴水損失率降低了22.00％（p<0.05），胸肌L*值降低了11.17％（p<0.01），胸肌a*值提高了41.81％（p

12、％（p0.05）；β-葡萄糖苷酶使肉雞十二指腸淀粉酶活性提高了30.43％（p<0.05），脂肪酶和胰蛋白酶分別提高12.40％（p>0.05）和57.93％（p>0.05）。Β-葡萄糖苷酶使肉雞粗蛋白和粗脂肪消化率顯著提高了9.02％（p＜0.05）和7.40％（p

13、血清指標(biāo)鈣、磷和堿性磷酸酶也無(wú)顯著變化。（6）飼糧中添加0.2％β-葡萄糖苷酶對(duì)脂肪代謝某些指標(biāo)產(chǎn)生影響：β-葡萄糖苷酶對(duì)肉雞的腹脂沉積、肌肉之間的脂肪沉積和尾部脂肪沉積都無(wú)顯著影響，β-葡萄糖苷酶對(duì)肉雞脂肪組織中HSL和LPL的活性均無(wú)顯著影響；β-葡萄糖苷酶對(duì)肉公雞甘油三酯、游離脂肪酸和總膽固醇沒(méi)有顯著影響，高密度脂蛋白膽固醇顯著提高了15.10％（p<0.05），低密度脂蛋白膽固醇降低了36.43％（p

14、糖苷酶提高肉雞的抗氧化能力：顯著提高了肉雞血清中超氧化物歧化酶的活性提高了16.45％（p<0.05），而使丙二醛的含量降低18.16％（p<0.05），肝臟中谷胱苷肽過(guò)氧化物酶和谷胱苷肽還原酶活性分別提高了33.00％（p0.05），IGF-I提高了57.78％（p<0.05）。