交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備及其生產(chǎn)大豆異黃酮活性苷元的研究.pdf

1、大豆異黃酮是從大豆中提取的一種植物雌性激素，具有天然抗氧化性、預(yù)防癌癥、保護(hù)心血管和防止骨質(zhì)疏松等多種生理活性。大豆異黃酮主要以無活性的糖苷形式存在，需經(jīng)人體腸道中微生物產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶水解為活性苷元才能被吸收進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用，但酶數(shù)量有限，導(dǎo)致生物利用度很低。本論文旨在利用無載體固定化技術(shù)制備高活性和高穩(wěn)定性的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體，為大豆異黃酮活性苷元的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。 本研究在參考Sheldon小組的研究基礎(chǔ)上，以黑曲

2、霉β-葡萄糖苷酶為研究對(duì)象，將游離β-葡萄糖苷酶用硫酸銨沉淀后，以戊二醛作交聯(lián)劑對(duì)其進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，制備新型的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體，并對(duì)影響交聯(lián)酶聚集體活性的主要因素進(jìn)行單因素考察，確定了交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備條件為: 聚集條件:0.34μ/ml的β-葡萄糖苷酶液在溶液體系pH值為7.0以及冰水浴條件下，經(jīng)90﹪飽和度的硫酸銨沉淀30 min，可獲得比較理想的B.葡萄糖苷酶聚集體。 交聯(lián)條件:β-葡萄糖苷酶聚集

3、體以5﹪戊二醛水溶液于30℃下交聯(lián)150min，再經(jīng)離心、洗滌數(shù)次后即得交聯(lián)B.葡萄糖苷酶聚集體，其酶活回收率可達(dá)77.4﹪。 酶學(xué)性質(zhì)研究表明，交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的最適溫度、最適pH值和K<,m>值分別為60℃、pH4.0和4.61×10-mol/L。與游離酶的對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體顯示出了更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和對(duì)底物的親和力。 對(duì)交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體進(jìn)行電鏡掃描顯示，其表面

4、疏水性高且糖基化程度低，結(jié)構(gòu)緊密，顆粒呈球狀形式，直徑約為800 nm左右，每個(gè)交聯(lián)酶聚集體中約包含4x10<'6>個(gè)β-葡萄糖苷酶分子：對(duì)β-葡萄糖苷酶聚集體交聯(lián)前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行紅外光譜分析表明，交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體中存在較多的由氨基與醛基反應(yīng)形成的酰胺鍵，驗(yàn)證了β-葡萄糖苷酶聚集體通過戊二醛的交聯(lián)作用，形成結(jié)構(gòu)緊密的交聯(lián)酶聚集體。將制備的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體用于合成大豆異黃酮活性苷元染料木素，對(duì)染料木苷水解轉(zhuǎn)化率約為66﹪。重