大豆異黃酮糖苷的超臨界流體萃取及固定化酶轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、大豆異黃酮是在大豆生長過程中形成的一類具有重要生理功能的次生代謝產(chǎn)物。大豆異黃酮共有12種異構(gòu)體，包括染料木素、大豆苷元、黃豆黃素3種游離型的苷元和各苷元與葡萄糖基、乙酰葡萄糖基、丙二酰葡萄糖基結(jié)合的9種糖苷。大豆中糖苷的比例可達(dá)到97％-98％，而苷元只占2％-3％。大豆異黃酮糖苷須轉(zhuǎn)化成苷元才能被機(jī)體吸收，發(fā)揮其生理活性作用。本論文采用超臨界CO2流體萃取法對脫脂豆粕中異黃酮糖苷染料木苷進(jìn)行提取，并通過固定化β-葡萄糖苷酶催化染料木

2、苷轉(zhuǎn)化為染料木素活性苷元進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下：
　　 1、通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，獲得的超臨界CO2流體萃取脫脂豆粕中染料木苷的優(yōu)化工藝條件是：乙醇用量300 mL/100 g脫脂豆粕，萃取溫度55℃，萃取壓力30 MPa，靜萃取時間120 min，動萃取時間60 min。該工藝條件下染料木苷的萃取率為794.5μg/g。通過借鑒固定床吸附/脫吸附傳質(zhì)理論，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，建立了超臨界流體萃取染料木苷的動力學(xué)模型，擬合了

3、實(shí)驗(yàn)條件下的超臨界萃取動力學(xué)曲線，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練誤差和預(yù)測誤差分別為1.8％和3.7％，模擬所得KLα與實(shí)驗(yàn)結(jié)果值的誤差約為9％：確定參數(shù)后的動力學(xué)模型可較為精確地定量描述萃取床層的溶質(zhì)濃度分布。
　　 2、通過對豆科蝶形花亞科中異黃酮含量較高的大豆等32種植物萌發(fā)種子和黑曲霉等32株微生物β-葡萄糖苷酶催化染料木苷轉(zhuǎn)化為染料木素的活性篩選，發(fā)現(xiàn)黑曲霉5-12的β-葡萄糖苷酶酶活力最大(633.76 U/mg蛋白)。分離純化和酶學(xué)性質(zhì)

4、研究結(jié)果表明，該黑曲霉β-葡萄糖苷酶分子量約為151.7 KDa，含2個亞基；分子結(jié)構(gòu)由α-螺旋7.1％、β-折疊49.0％、轉(zhuǎn)角21.7％和無規(guī)卷曲22.2％組成；具有較高的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。
　　 3、正交試驗(yàn)和三因素二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)優(yōu)化出黑曲霉5-12在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的適宜培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)工藝是：轉(zhuǎn)速400 r/min，溫度30℃，接種量10％，優(yōu)化培養(yǎng)基(g/L)是：麥麩

5、28.4，(NH4)2SO41.2,KH2PO42.0。黑曲霉5-12在優(yōu)化的產(chǎn)酶條件下發(fā)酵3天，發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶的酶活達(dá)到1493.90 U/mL。其細(xì)胞生長模型符合Monod方程，產(chǎn)酶動力學(xué)符合Luedeking-Piret方程。利用黑曲霉5-12細(xì)胞能夠形成聚集體的特性，建立了黑曲霉5-12無載體固定化發(fā)酵β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)體系。
　　 4、以海藻酸鈉為載體，采用交聯(lián)-包埋法，實(shí)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酶的有效固定化。與游

6、離酶相比，固定化酶最適溫度、最適pH值和Km值分別由50℃、4.5和2.99μg/mL，下降到40℃、4.0和2.02μg/mL，具有更強(qiáng)的耐酸性和穩(wěn)定性。該固定化酶用于催化大豆異黃酮染料木苷轉(zhuǎn)化活性苷元染料木素，染料木苷轉(zhuǎn)化率達(dá)100％，重復(fù)使用8次后，轉(zhuǎn)化率保持75％以上。
　　 5、以磁性納米氮化鋁顆粒為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，在20℃、pH5.0、100 r/min下作用3.5 h后，制備了固定化β-葡萄糖苷酶。掃描電鏡

7、、紅外光譜、差熱分析表征了納米顆粒固定化酶的結(jié)構(gòu)特征。與游離酶相比，磁性納米氮化鋁顆粒固定化酶最適溫度、最適pH值和Km值分別由50℃、4.5和2.99μg/mL上升為55℃、5.0和6.41μg/mL，具有良好的貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。該固定化酶用于催化大豆異黃酮染料木苷轉(zhuǎn)化活性苷元染料木素，染料木苷轉(zhuǎn)化率達(dá)88％，重復(fù)使用8次后，轉(zhuǎn)化率保持50％以上。與海藻酸鈉固定化酶比較，磁性納米氮化鋁顆粒固定化酶對底物親和力和染料木苷轉(zhuǎn)化率稍有