hBMP-2和FGF-2雙基因共轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對(duì)其增殖及成骨分化的影響.pdf

1、[目的]
　　 用人骨形成蛋白-2(hBMP-2)和人成纖維細(xì)胞生長因子-2(hFGF-2)共表達(dá)腺病毒載體(Ad-hBMP2-IRES-hFGF2)感染人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bBMSCs)，研究其對(duì)hBMSCs活性、增殖和成骨分化的影響。
　　 [方法]
　　 按10、30、50感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的感染量，分別把Ad-hBMP2-IRES-hFGF2和Ad-EGF

2、P病毒液稀釋到配制好的培養(yǎng)基中，按空白對(duì)照組(hBMSC空白細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(hBMSC細(xì)胞感染Ad-EGFP)、陽性對(duì)照組(hBMSCs細(xì)胞感染Ad-BMP2-IRES-FGF2)分組感染人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)，熒光顯微鏡觀察感染效果，確定最佳感染量。按最佳感染量如上述分組轉(zhuǎn)染hBMSCs，PCR分析目的基因的表達(dá)，Western Blot分析目的蛋白的表達(dá)，CCK8、臺(tái)盼藍(lán)染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖、活性及細(xì)胞周期，了

3、解目的基因的表達(dá)情況及感染對(duì)hBMSCs活性及增殖的影響；ELASA檢測(cè)Ⅰ型膠原、茜素紅及Von kossa染色了解細(xì)胞礦化情況，以判斷其成骨分化情況。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)重組腺病毒以不同的MOI去感染細(xì)胞，在48小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，可見MOI=10時(shí)細(xì)胞感染率為80％左右，當(dāng)MOI=30時(shí)，細(xì)胞感染率已達(dá)到90％，MOI=50時(shí)，細(xì)胞感染數(shù)下降。
　　 (2)PCR檢測(cè)顯示感染后試驗(yàn)組在468

4、bp和183bp處出現(xiàn)明亮條帶，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組在該位置出現(xiàn)的條帶弱陽性或未見條帶。Wester blot檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組有相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為14000的hBMP-2蛋白條帶和Mr約為18000的hFGF-2蛋白條帶，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組為弱陽性條帶。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示：與未感染組比較，空載體感染組OD值低于未感染組，而目的基因共感染組的OD值明顯高于未感染組。臺(tái)盼藍(lán)染色空白對(duì)照組(hBMSCs空白細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(h

5、BMSCs細(xì)胞感染Ad-EGFP)、實(shí)驗(yàn)組(hBMSCs細(xì)胞感染Ad-BMP2-IRES-FGF2)存活率分別為99.8％、99.1％、98.9％，P>0.05，統(tǒng)計(jì)分析無差異。細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index)PrI=S％+G2M％分別為17.47％、9.92％、6.10％，統(tǒng)計(jì)分析有顯著差異，說明hBMP-2和hFGF-2雙基因共感染對(duì)BMSCs細(xì)胞有明顯的影響，

6、即增殖期細(xì)胞比例明顯增加，能促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　 (3)ELASA檢測(cè)試驗(yàn)組Ⅰ型膠原含量在早期(3-7天)明顯高于未感染組及空載體感染組。目的基因共感染組hBMSC融合后繼續(xù)培養(yǎng)，形成細(xì)胞結(jié)節(jié)，中心出現(xiàn)基質(zhì)沉積，茜素紅染色顯示明顯鈣結(jié)節(jié)，而未感染組及空載體感染組則無明顯鈣結(jié)節(jié)形成。Von kossa染色第七天時(shí)就開始為陽性，黑色沉著物分布于細(xì)胞外基質(zhì)中，呈網(wǎng)狀，第十四天時(shí)明顯增多。
　　 [結(jié)論]
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