生肌液對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨活性和凋亡狀態(tài)影響的研究.pdf

1、臨床上由于骨折或其它原因引起的骨缺損很常見，且治療困難，目前采用的自體骨和異體骨移植均有各自的不足之處，自體骨移植的骨量受到限制，另外也增加了病人的痛苦，而異體骨移植可能出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)和其它的并發(fā)癥。將組織工程化骨用于骨缺損的修復(fù)是臨床治療的趨勢所在，即從病人體內(nèi)取少量的種子細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)及培養(yǎng)，使其在短時間內(nèi)大量增殖，再復(fù)合以支架材料，植入病人的骨缺損處，以達(dá)到治療的目的，其中對種子細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)和快速增殖的刺激因素是研究的重點之一

2、，本實驗旨在研究中藥生肌液對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MarrowStromaCells，MSCs)功能狀態(tài)的影響。 目的：觀察中藥生肌液對MSCs增殖、分化和凋亡的影響，篩選有利于MSCs高效增殖、定向成骨分化并能抑制其凋亡狀態(tài)的相關(guān)因素，從而為研制一種來源相對豐富、組織相容性好和成骨能力強(qiáng)的組織工程骨創(chuàng)造條件。 方法：1.取成年家兔脛骨骨髓，用密度梯度離心—貼壁篩選的方法，獲取MSCs并進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。2.分別采用水煎法和微波

3、法提取全方生肌液和去當(dāng)歸生肌液，利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和MTT檢測的方法篩選最佳制備方法和組方生肌液。3.采用不同組方生肌液，利用空白對照、標(biāo)準(zhǔn)對照、陰性對照等比對方法，觀察生肌液對MSCs增殖的影響。4.通過形態(tài)學(xué)觀察和檢測細(xì)胞分泌堿性磷酸酶和骨鈣素的方法，比較不同組方生肌液對MSCs成骨活性的影響。5.利用形態(tài)學(xué)觀測、熒光顯微分析和流式細(xì)胞分析的方法，考察生肌液對MSCs凋亡狀態(tài)的影響。 結(jié)果：1.采用密度梯度離心—貼壁篩選的方

4、法，獲取家兔骨髓中的MSCs，培養(yǎng)第3天，大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁生長，至第10天時細(xì)胞已融合成片，呈指紋狀排列，傳代后增殖能力旺盛。2.MTT結(jié)果顯示全方生肌液水煎提取法和微波法提取法均以4mg/ml組優(yōu)于其它濃度生肌液組，也優(yōu)于原方法提取生肌液組和普通培養(yǎng)液組。去當(dāng)歸生肌液水煎提取法的MTT值明顯高于微波法提取法。3.MTT檢測結(jié)果顯示，不同組方生肌液培養(yǎng)處于凋亡狀態(tài)的MSCs，在24小時時間點，含血清培養(yǎng)液配制的全方生肌液和去當(dāng)歸生肌液

5、高于去當(dāng)歸及生地生肌液，而在48小時時間點差別不明顯。4.生肌液對處于不同增殖狀態(tài)的MSCs分泌堿性磷酸酶、骨鈣素的作用不同，其中經(jīng)過凋亡誘導(dǎo)的MSCs在48小時時間點的值高于未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)MSCs，生肌液組間無統(tǒng)計學(xué)差別。5.與對照組相比，生肌液培養(yǎng)的MSCs處于凋亡狀態(tài)的量較少，并且大部分處于早期凋亡狀態(tài)，生肌液組間無統(tǒng)計學(xué)差別。 結(jié)論：1.從成年家兔骨髓中所獲得的MSCs，具有分離容易、貼壁迅速、增殖速度快的特點，經(jīng)過多次傳

6、代培養(yǎng)后，細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的分裂增殖能力，是理想的骨組織工程種子細(xì)胞。2.實驗發(fā)現(xiàn)，全方生肌液的水煎提取法和微波提取法，其最佳濃度均在4mg/ml附近，二者對于MSCs的增殖作用無差異；去當(dāng)歸生肌液的水煎法提取法明顯優(yōu)于微波法提取法。3.對于處于凋亡狀態(tài)的MSCs，全方生肌液與去當(dāng)歸生肌液均有明顯促進(jìn)MSCs增殖的作用，而去當(dāng)歸及生地生肌液則對此無明顯作用，表明在促進(jìn)MSCs增殖方面，當(dāng)歸和生地在組方藥中的作用是不同的，生地在這方面的作用