氨基與羧基功能化修飾介孔SiO2(SBA-15)致血管內皮細胞毒性研究.pdf

1、背景：介孔二氧化硅(介孔SiO2)由于其穩(wěn)定的骨架結構、介孔孔徑均一可調、表面易于修飾等獨特優(yōu)良特性而廣泛應用在化學催化、分離科學、生物醫(yī)藥等眾多領域，特別是其可在生物醫(yī)學領域作為藥物載體、基因載體而引起人們廣泛的關注。因介孔SiO2進入臨床使用后，人體的暴露幾率更高，因此，介孔SiO2對人體的影響作用不容忽視。血管內皮細胞是有害物質進入機體循環(huán)系統(tǒng)的第一道防線，既往研究發(fā)現血管內皮細胞的損傷是許多心血管疾病的重要誘因。研究發(fā)現表面功能

2、化修飾在影響介孔 SiO2細胞毒性效應方面扮演者重要角色。鑒于介孔 SiO2作為藥物、基因載體與血管內皮細胞接觸的頻繁性，其心血管毒性效應不容忽視。
　　目的：本研究擬通過 NH2-SBA-15與 COOH-SBA-15致人臍靜脈血管內皮細胞毒性，探究經氨基（-NH2）和羧基（-COOH）修飾后的表面功能化介孔 SiO2致血管內皮細胞毒性效應及其細胞毒性作用機制，為介孔SiO2及表面功能化介孔SiO2致在臨床上的安全應用提供科學的

3、理論依據。
　　方法：本研究以SBA-15型介孔SiO2和人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)為研究對象，采用后嫁接法將氨基（-NH2）和羧基（-COOH）修飾在SBA-15上，通過體外細胞培養(yǎng)分別建立 HUVECs暴露于表面功能化介孔 SiO2的暴露模型。采用紅外光譜(FTIR)、N2吸附-脫附、X射線衍射(XRD)、透射電子顯微鏡(TEM)和動態(tài)光散射粒度分析儀(DLS)等手段對 NH2-SBA-15和COOH-SBA-15進

4、行了表征。采用染毒濃度為0μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL進行 MTT及 CCK-8實驗，用以定量測定功能化修飾介孔SiO2致HUVECs增殖活性影響并確定后續(xù)實驗染毒劑量組（0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL）；采用染毒濃度為0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用于HUVECs24h后，微量酶標法測

5、定培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶（LDH）的活力，硝酸還原酶法測定培養(yǎng)液上清液中一氧化氮(NO)的含量，二氯熒光乙酰乙酸鹽（DCFH-DA）探針結合熒光顯微鏡技術及熒光酶標儀定性、定量檢測SBA-15作用下HUVECs細胞活性氧(ROS)水平，蛋白印跡（Western Blot）技術分別測定細胞黏附因子-1（ICAM-1）和血管細胞黏附因子-1（VCAM-1）蛋白表達水平。
　　結果：
　　1.功能化修飾介孔SiO2的表征
　

6、　-NH2和-COOH成功地嫁接到介孔材料SBA-15上，NH2-SBA-15和COOH-SBA-15仍保持了SBA-15的一維六方介孔結構，具有典型的介孔結構特征，三種樣品材料在1640細胞培養(yǎng)基中分散穩(wěn)定，未發(fā)生聚集。
　　2.功能化修飾介孔SiO2的細胞毒性分析
　　與陰性對照組（0μg/mL）比較，SBA-15、NH2-SBA-15、COOH-SBA-15組細胞抑制率均升高（P＜0.05），隨著劑量濃度的升高，細胞抑

7、制率逐漸升高，且具有明顯的劑量-反應關系；低濃度時NH2-SBA-15、COOH-SBA-15組對細胞抑制率高于SBA-15組，隨著染毒濃度增加，在400和800μg/mL時SBA-15組對細胞抑制率高于表面功能化組（P＜0.05），在800μg/mL時COOH-SBA-15組細胞抑制率最低（P＜0.05）。
　　與陰性對照組（0μg/mL）比較，SBA-15、NH2-SBA-15、COOH-SBA-15組都不同程度地損傷了細胞膜

8、，隨著劑量濃度的升高，LDH釋放量隨之升高（P＜0.05），相同劑量不同樣品材料組比較顯示功能化后 SBA-15組，細胞培養(yǎng)液中LDH的表達水平降低且COOH-SBA-15組最低（P＜0.05）。
　　3.功能化修飾介孔SiO2致HUVECs氧化應激效應
　　與陰性對照組（0μg/mL）比較，SBA-15、NH2-SBA-15、COOH-SBA-15組都不同程度地促進了內皮細胞ROS的表達水平（P＜0.05），隨著劑量濃度的

9、升高，ROS的表達水平隨之升高（P＜0.05），相同劑量不同樣品材料組比較顯示功能化后SBA-15組，內皮細胞ROS的表達水平降低且COOH-SBA-15組最低（P＜0.05）。熒光顯微鏡檢測結果顯示：陰性對照組綠色熒光不明顯，而SBA-15、NH2-SBA-15、COOH-SBA-15組都發(fā)出了不同強度地熒光，同劑量不同樣品材料組比較，功能化組熒光強度較弱且羧基化組最弱，陽性對照組熒光強度最強。
　　4.功能化修飾介孔SiO2對

10、HUVECs細胞功能影響的分析
　　與陰性對照組（0μg/mL）比較，SBA-15、NH2-SBA-15、COOH-SBA-15組都不同程度地促進了內皮細胞NO、ICAM-1和VCAM-1的表達水平（P＜0.05），隨著劑量濃度的升高，HUVECs的上清液中NO含量和細胞內ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達水平隨著SBA-15染毒濃度的升高呈上升趨勢（P＜0.05），相同劑量不同樣品材料組比較顯示功能化修飾SBA-15組，內皮細

11、胞NO、ICAM-1和VCAM-1的表達水平降低且COOH-SBA-15組最低（P＜0.05）。
　　結論：功能化修飾介孔SiO2對HUVECs存在細胞毒性，損傷細胞膜，相比較而言功能化修飾后細胞毒性降低，羧基修飾組（COOH-SBA-15）毒性最低，有著較好的生物安全性。通過三種材料致細胞抑制率及LDH和ROS表達水平比較，氧化損傷和細胞膜損傷可能是其細胞毒性作用機制中的兩種。介孔SiO2可能通過誘導HUVECs的NO、ICAM