電壓依賴性外向K+通道在納米SiO2致人血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性效應(yīng)中的作用.pdf

1、隨著納米材料的發(fā)展,人們對納米顆粒的暴露機(jī)會越來越多。納米顆粒廣泛見于納米材料的生產(chǎn)和使用。此外,工業(yè)環(huán)境的熱加工生產(chǎn),以及大氣環(huán)境污染,使得生產(chǎn)工人和普通人群均可接觸到它,因此其潛在的健康影響將成為一個重要的研究領(lǐng)域。已有研究證明,納米顆?？蛇M(jìn)入血液系統(tǒng),分布全身,導(dǎo)致心血管疾病。有研究表明,炎性復(fù)合體(a protein complex)可介導(dǎo)炎性反應(yīng)的發(fā)生;胞內(nèi)K+外流,即降低胞內(nèi)K+離子濃度,是炎性體激活的前提條件之一。本實(shí)驗(yàn)旨

2、在為外向K+通道在炎性反應(yīng)中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:研究探討電壓依賴性外向K+通道(voltage dependent potassium channel,Kv)在納米二氧化硅(SiO2)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞毒性反應(yīng)中的作用,以及K+外流與炎性反應(yīng)的關(guān)系。
　　方法:第一部分實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)。以細(xì)胞正常培養(yǎng)為

3、陰性對照組。單獨(dú)添加20mg/ml納米SiO2為陽性對照組。在20mg/ml納米SiO2基礎(chǔ)上,再添加不同劑量的特異性K+通道阻斷劑斑蝎毒素MGTX(Margatoxin,終濃度為0.1、1、10、100nM)處理細(xì)胞為阻斷劑組,檢測各組細(xì)胞存活率,以及細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)漏出率、腫瘤壞死因子(TNF-a)以及白介素-6(IL-6)釋放量,探討通道阻斷與否對各項指標(biāo)的影響。第二部分實(shí)驗(yàn)運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗測定細(xì)胞上外向Kv電流,

4、即時加入K+通道阻斷劑(TEA、4-AP以及MGTX)驗(yàn)證。由擬合曲線求得各阻斷劑該K+電流的半數(shù)抑制濃度(ID50)。以正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對照組,加入不同濃度(20mg/ml、40mg/ml)的納米SiO2處理細(xì)胞,記錄Kv最大電流幅值得到最低作用劑量,電流-電壓曲線以及通道動力學(xué)變化。同時運(yùn)用免疫熒光技術(shù)初步觀察細(xì)胞膜外向K+通道亞型Kv1.3通道的表達(dá)。
　　結(jié)果:加入K+通道阻斷劑MGTX后,與陽性對照組比較,隨著阻斷劑劑量

5、增高細(xì)胞存活率有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。LDH漏出率先降低后升高,最終仍顯著低于陽性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MGTX作用下納米SiO2誘導(dǎo)細(xì)胞釋放TNF-a量顯著降低,與陽性對照比較差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)。低劑量MGTX(0.1nM)即可顯著降低細(xì)胞IL-6的釋放量(P<0.05)。指標(biāo)標(biāo)化分析表明,三種K+通道阻斷劑中4-AP對納米SiO2毒性的作用最為顯著,MGTX則處于中間位置,TE

6、A的作用最弱。通過全細(xì)胞膜片鉗模式記錄到HUVECs細(xì)胞膜上存在一個激活和失活都較緩慢、具有電壓依賴性和延遲整流特性的外向電流。K+通道阻斷劑TEA、4-AP以及MGTX使得該外向K+電流受到不同程度的抑制。5mM4-AP可完全阻斷該電流,且沖洗去除后電流不能恢復(fù)。100nM MGTX可部分阻斷該電流,且沖洗后電流能部分恢復(fù),這說明所記錄的電流是Kv1.3通道的電流。與對照組比較,20mg/ml納米SiO2使Kv電流最大幅度值增加了63

7、.9％,但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而40mg/ml納米SiO2使之增高了120.2%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0385)。給予細(xì)胞不同電壓刺激,在納米SiO2作用下外向Kv電流逐漸增大,與對照比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通道動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn),納米SiO2可使外向Kv通道穩(wěn)態(tài)激活曲線顯著左移,半數(shù)激活電壓V1/2由11.96±1.17mV左移至4.25±1.55mV,斜率因子k由13.54±1.16顯著降低至11.4

8、5±1.49,與對照比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到,加入納米SiO2后細(xì)胞變?yōu)椴灰?guī)則形,細(xì)胞膜斷裂,細(xì)胞核破碎等,表現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性變化。在細(xì)胞膜完整部位熒光強(qiáng)度增強(qiáng),Kv1.3表達(dá)量升高。
　　結(jié)論:MGTX可抑制納米SiO2誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性反應(yīng),且廣泛外向型K+通道阻斷劑4-AP的抑制作用更顯著。HUVECs細(xì)胞上存在外向Kv通道,表現(xiàn)延遲整流特性。納米SiO2可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生毒性反應(yīng),外向Kv