建立糖鏈長(zhǎng)度可調(diào)節(jié)的大腸桿菌N-連接糖基化系統(tǒng).pdf

1、空腸彎曲菌Campylobacter jejuni為侵染人類消化道粘膜的致病菌，是引起細(xì)菌性腹瀉的主要誘因之一。1999年，Szymanski等人首次在Cjejuni中發(fā)現(xiàn)了編碼N-糖基化途徑的pgl基因簇。原核N-連接糖基化系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，尤其是原核寡糖基轉(zhuǎn)移酶(OST)PglB的發(fā)現(xiàn)，為利用原核表達(dá)系統(tǒng)合成N-連接糖蛋白提供了一條新的方法。
　　 C.jejuni中的N-連接糖基化途徑同E.coli中Wzy-dependent途

2、徑進(jìn)行的O-PS合成過程極為相似，首先在胞質(zhì)內(nèi)由各種糖基轉(zhuǎn)移酶向包埋于質(zhì)膜的undecaprenol上依次添加不同的單糖形成寡糖前體。寡糖前體經(jīng)翻轉(zhuǎn)酶翻轉(zhuǎn)到周質(zhì)空間后，或由細(xì)菌寡糖基轉(zhuǎn)移酶(OST)PglB將寡糖前體轉(zhuǎn)移到蛋白底物中，或經(jīng)多聚化為O-PS后被O-抗原連接酶WaaL連接到類脂A-核心寡糖上形成LPS。這種相似性為將兩個(gè)途徑相結(jié)合，以O(shè)-PS代替C.jejuni中的七糖前體提供了理論基礎(chǔ)，而PglB相對(duì)寬松的底物特異性將這一

3、設(shè)想變成了現(xiàn)實(shí)。本文就利用細(xì)菌OST PglB建立Ecoli N-連接糖基化系統(tǒng)、一步生物法生產(chǎn)糖-蛋白綴合物疫苗、以及PglB的性質(zhì)等三方面展開研究。
　　 敲除E coli086:K61：B7中waaL基因得到重組菌B712，使連接在脂載體上的O-PS在周質(zhì)空間內(nèi)積累。將來源于C.jejuni NCTC11168的pglB和acrA克隆到B712后，PglB能夠催化積累在周質(zhì)空間內(nèi)的O-PS向AcrA的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，獲得帶有0

4、86:B7O-PS的AcrA(AcrA-O-PS)。本文利用細(xì)菌OST成功地建立了E.coliN-連接糖基化系統(tǒng)，為以下工作的展開創(chuàng)造了平臺(tái)。
　　 在O-PS合成過程中，0-抗原長(zhǎng)度決定蛋白Wzz在O-PS聚合時(shí)負(fù)責(zé)控制鏈長(zhǎng)，不同的E.coli菌株由于Wzz不同而具有鏈長(zhǎng)不等的O-PS。本文用于建立E.cobN-連接糖基化系統(tǒng)的086:B7具有較短鏈長(zhǎng)的O-PS，同為086血清型的另一菌株086:H2則具有中等鏈長(zhǎng)的O-PS。

5、將WzzB7替換為WzzH2后，顯著地增加了AcrA-O-PS中O-PS的糖鏈長(zhǎng)度。因此，糖鏈長(zhǎng)度可調(diào)節(jié)的E.coliN_連接糖基化系統(tǒng)得以成功構(gòu)建。
　　 利用E.coli N-連接糖基化系統(tǒng)，可以將細(xì)菌O-PS以N-糖鏈的形式連接到蛋白上，這種糖-蛋白綴合物可以用作預(yù)防細(xì)菌感染的疫苗。為此，將E coliN-連接糖基化系統(tǒng)中的蛋白底物由模式蛋白AcrA替換為廣泛使用的疫苗載體蛋白破傷風(fēng)毒素C片段Tic和白喉毒素?zé)o毒突變體CR

6、MI97，并向兩者中引入PglB的糖基化位點(diǎn)，對(duì)一步生物法合成糖-蛋白綴合物進(jìn)行了初步探索。
　　 利用TMHMM軟件預(yù)測(cè)PglB的N-端具有11個(gè)穿膜a-螺旋。本文還構(gòu)建了缺失第1個(gè)、第1-5個(gè)、第1-8個(gè)和第1-11個(gè)穿膜a-螺旋的截短PglB突變體(tPglBs) P1、P5、P8和Pll，并利用E.coil N-連接糖基化系統(tǒng)對(duì)上述截短PglB突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些截短PglB突變體均失去了轉(zhuǎn)糖基活性，說明N

7、-端結(jié)構(gòu)域?qū)glB的轉(zhuǎn)糖基活性至關(guān)重要。
　　 總之，糖鏈長(zhǎng)度可以調(diào)節(jié)的E.coli N-連接糖基化系統(tǒng)的建立為生產(chǎn)糖-蛋白綴合物疫苗開辟了新的途徑。研究表明將這些細(xì)菌O-PS共價(jià)連接到載體蛋白以后得到的糖-蛋白綴合物能夠有效地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生TD免疫應(yīng)答，保護(hù)人體免受細(xì)菌感染。目前普遍應(yīng)用于生產(chǎn)的兩步化學(xué)法合成糖.蛋白綴合物疫苗具有多次發(fā)酵純化、成本高昂等缺點(diǎn)。而本文建立的一步生物法合成糖-蛋白綴合物疫苗僅需一次發(fā)酵、純化就能夠