漢坦病毒GM04-38株N-聯(lián)糖基化位點在細胞融合中的作用.pdf

1、目的： N-聯(lián)寡糖鏈可以在很多方面影響蛋白的功能。已有報道顯示某些病毒融合蛋白的寡糖鏈缺失可使病毒的細胞融合功能缺陷或丟失。已有報道顯示漢坦病毒的G2糖蛋白可能是其融合蛋白。鑒于漢坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白G1和G2也是通過N-聯(lián)糖基化作用來修飾的,本研究擬通過實驗對漢坦病毒N-聯(lián)糖基化位點在細胞融合中的作用進行初步探討。從而為闡明HV的細胞融合機制、研制有效的漢坦病毒新型疫苗和治療制劑奠定基礎(chǔ)。
　　 方法根據(jù)GM04-

2、38株M片段cDNA基因序列應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計引物,同源重組PCR法構(gòu)建5個單個氨基酸突變的N-聯(lián)糖基化位點的克隆載體。PCR擴增N-聯(lián)糖基化位點突變體的編碼區(qū)基因,雙酶切后與經(jīng)過同樣雙酶切的表達載體pCAGGS/MCS連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,氨芐青霉素篩選N-聯(lián)糖基化位點單個氨基酸突變體的表達載體。經(jīng)雙酶切和測序證實。將真核表達質(zhì)粒G1Bg1,GmG2及4個G1突變體,1個G2突變體提取后分別共轉(zhuǎn)染Vero E6細胞,間接

3、免疫熒光檢測蛋白表達情況,免疫印跡實驗確定糖蛋白表達情況,并經(jīng)酸性MEM處理、Giemsa染色后觀察細胞融合現(xiàn)象的發(fā)生。
　　 結(jié)果1.構(gòu)建了5個N-聯(lián)糖基化位點單個氨基酸突變的克隆載體N134A、N235A、N347A、N399A、N928A雙酶切鑒定載體長度約為2.7kb；N134A、N235A、N347A、N399A突變體長度約為2.1kb；N928A突變體長度約為1.6kb,并經(jīng)測序證實。
　　 2.構(gòu)建了5個N

4、-聯(lián)糖基化位點單個氨基酸突變的表達載體G1Bg1-N134A、GlBg1-N235A、G1Bg1-N347A、G1Bg1-N399A、GmG2-N928A、雙酶切鑒定,載體長度為4.7kb；N134A、N235A、N347A、N399A突變體目的片段長度約為2.1kb；N928A突變體目的片段長度約為1.6kb,并經(jīng)測序證實。
　　 3.間接免疫熒光實驗顯示野毒株G1Bg1與GmG2共轉(zhuǎn)染組、G1Bg1及各N-聯(lián)糖基化位點突變體

5、轉(zhuǎn)染組均有亮綠色熒光信號產(chǎn)生,呈胞漿分布。
　　 4.免疫印跡實驗顯示野毒株G1Bg1與GmG2共轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)兩條帶,分別為68KDa和55KDa,N134A突變體轉(zhuǎn)染組不顯示G1條帶,其余各突變體轉(zhuǎn)染組均顯示G1、G2兩條帶。
　　 5.共轉(zhuǎn)染N134A或N928A突變體組未出現(xiàn)細胞融合現(xiàn)象,而其他突變體及野毒株GlBg1與GmG2共轉(zhuǎn)染后則出現(xiàn)融合現(xiàn)象。
　　 結(jié)論 G1上的134位點可能與蛋白正確折疊有密切關(guān)