漢坦病毒GM04-38株N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)在細(xì)胞融合中的作用.pdf

1、目的： N-聯(lián)寡糖鏈可以在很多方面影響蛋白的功能。已有報(bào)道顯示某些病毒融合蛋白的寡糖鏈缺失可使病毒的細(xì)胞融合功能缺陷或丟失。已有報(bào)道顯示漢坦病毒的G2糖蛋白可能是其融合蛋白。鑒于漢坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白G1和G2也是通過(guò)N-聯(lián)糖基化作用來(lái)修飾的,本研究擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)漢坦病毒N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)在細(xì)胞融合中的作用進(jìn)行初步探討。從而為闡明HV的細(xì)胞融合機(jī)制、研制有效的漢坦病毒新型疫苗和治療制劑奠定基礎(chǔ)。
　　 方法根據(jù)GM04-

2、38株M片段cDNA基因序列應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物,同源重組PCR法構(gòu)建5個(gè)單個(gè)氨基酸突變的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的克隆載體。PCR擴(kuò)增N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)突變體的編碼區(qū)基因,雙酶切后與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的表達(dá)載體pCAGGS/MCS連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,氨芐青霉素篩選N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)單個(gè)氨基酸突變體的表達(dá)載體。經(jīng)雙酶切和測(cè)序證實(shí)。將真核表達(dá)質(zhì)粒G1Bg1,GmG2及4個(gè)G1突變體,1個(gè)G2突變體提取后分別共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞,間接

3、免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)情況,免疫印跡實(shí)驗(yàn)確定糖蛋白表達(dá)情況,并經(jīng)酸性MEM處理、Giemsa染色后觀察細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)生。
　　 結(jié)果1.構(gòu)建了5個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)單個(gè)氨基酸突變的克隆載體N134A、N235A、N347A、N399A、N928A雙酶切鑒定載體長(zhǎng)度約為2.7kb；N134A、N235A、N347A、N399A突變體長(zhǎng)度約為2.1kb；N928A突變體長(zhǎng)度約為1.6kb,并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。
　　 2.構(gòu)建了5個(gè)N

4、-聯(lián)糖基化位點(diǎn)單個(gè)氨基酸突變的表達(dá)載體G1Bg1-N134A、GlBg1-N235A、G1Bg1-N347A、G1Bg1-N399A、GmG2-N928A、雙酶切鑒定,載體長(zhǎng)度為4.7kb；N134A、N235A、N347A、N399A突變體目的片段長(zhǎng)度約為2.1kb；N928A突變體目的片段長(zhǎng)度約為1.6kb,并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。
　　 3.間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示野毒株G1Bg1與GmG2共轉(zhuǎn)染組、G1Bg1及各N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)突變體

5、轉(zhuǎn)染組均有亮綠色熒光信號(hào)產(chǎn)生,呈胞漿分布。
　　 4.免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示野毒株G1Bg1與GmG2共轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)兩條帶,分別為68KDa和55KDa,N134A突變體轉(zhuǎn)染組不顯示G1條帶,其余各突變體轉(zhuǎn)染組均顯示G1、G2兩條帶。
　　 5.共轉(zhuǎn)染N134A或N928A突變體組未出現(xiàn)細(xì)胞融合現(xiàn)象,而其他突變體及野毒株GlBg1與GmG2共轉(zhuǎn)染后則出現(xiàn)融合現(xiàn)象。
　　 結(jié)論 G1上的134位點(diǎn)可能與蛋白正確折疊有密切關(guān)