N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅲ通過對α5β1整合素N-糖基化修飾調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲.pdf

1、妊娠早期，滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附并侵入母體子宮內(nèi)膜是胚胎著床和胎盤形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶 Ⅲ（N-acetylglucosaminyltransferase Ⅲ, GnT-Ⅲ）是N-糖基化修飾的一個關(guān)鍵酶， GnT-Ⅲ及其催化產(chǎn)物平分型糖支鏈結(jié)構(gòu)（ bisecting N-acetylglucosamine, bisecting GlcNAc）參與調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲，但GnT-Ⅲ及其催化產(chǎn)物平分型糖支鏈結(jié)構(gòu)在人妊娠各時期的

2、胎盤發(fā)育、滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲過程中的功能及作用機(jī)制尚不清楚。此外，已有文獻(xiàn)報道α5β1整合素上糖基化修飾的改變可引起腫瘤細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲行為的改變。
　　目的：
　　本研究旨在通過比較人正常妊娠不同時期胎盤組織中GnT-Ⅲ及其催化產(chǎn)物平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)的表達(dá)和分布差異，以及用小干擾RNA法（small interfering RNA，SiRNA）在人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3中建立MGAT3基因（編碼GnT-Ⅲ）沉默模型，

3、來探索GnT-Ⅲ和平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)對功能蛋白α5β1的N-糖基化修飾和滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的調(diào)控，為臨床不孕癥和自然流產(chǎn)等疾病診治探尋新的分子靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.我們分別采用免疫組織化學(xué)、實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)印跡、免疫熒光法檢測GnT-Ⅲ，用生物素化的蠶豆紅細(xì)胞凝集素（ biotinylated phaseolus vulgaris erythroagglutinin， PHA-E）印跡、PH

4、A-E凝集素組織化學(xué)及PHA-E凝集素?zé)晒夥z測GnT-Ⅲ的催化產(chǎn)物平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)在人正常妊娠各階段的胎盤組織和不同的人滋養(yǎng)層細(xì)胞株中的表達(dá)和分布；
　　2.用SiRNA法在人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3中建立MGAT3基因沉默模型，運(yùn)用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、transwell細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞外基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)技術(shù)分析沉默MGAT3基因?qū)?xì)胞增殖、遷移、侵襲及與細(xì)胞外基質(zhì)黏附等生物學(xué)效應(yīng)的影響，用qRT-PCR、蛋白質(zhì)印

5、跡、免疫共沉淀技術(shù)分析沉默MGAT3基因?qū)Ζ?β1整合素的表達(dá)和糖基化修飾的影響，并用蛋白質(zhì)印跡法初步分析相關(guān)信號通路的變化。
　　結(jié)果：
　　1.在人正常妊娠絨毛組織中，GnT-Ⅲ主要表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞（cytotrophoblasts，CTBs）和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞（syncytiotrophoblasts， STBs）的細(xì)胞質(zhì)，且在妊娠前三個月的表達(dá)強(qiáng)于妊娠中三個月（P<0.05）和妊娠后三個月（P<0.05）；GnT-

6、Ⅲ的催化產(chǎn)物平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)在妊娠前三個月絨毛中的含量顯著高于妊娠后三個月（P<0.05）。
　　2. GnT-Ⅲ在絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞（extravillous cytotrophoblasts，EVTs）中高表達(dá)，且在有EVTs侵入的蛻膜組織也呈高表達(dá)，而在無EVTs侵入的蛻膜組織中表達(dá)很弱甚至無表達(dá)，并且GnT-Ⅲ在有EVTs細(xì)胞侵入的蛻膜組織中妊娠前三個月的表達(dá)高于妊娠后三個月。
　　3. PHA-E凝集素組織化學(xué)分

7、析結(jié)果顯示平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)主要分布在滋養(yǎng)層細(xì)胞的表面，且在妊娠前三個月絨毛中大量分布，在足月胎盤絨毛中分布較少，且妊娠前三個月高于妊娠后三個月（P<0.05）。
　　4.用SiRNA法在人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3中沉默MGAT3基因（編碼GnT-Ⅲ）， JEG-3細(xì)胞在MGAT3基因沉默后其增殖能力未受到明顯影響，而細(xì)胞遷移、侵襲能力以及與細(xì)胞外基質(zhì)黏附能力明顯下降;MGAT3基因沉默后α5β1整合素的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白