體外成熟對小鼠卵母細(xì)胞、胚胎及出生后子代的影響.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：體外成熟對小鼠卵母細(xì)胞、胚胎及出生后子代生長發(fā)育行為學(xué)的影響
　　 目的：本研究擬通過建立小鼠卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturaTiO2，IVM)技術(shù)平臺，揭示IVM對小鼠卵母細(xì)胞，胚胎及出生后子代生長發(fā)育及行為學(xué)的影響，闡明IVM的短期及中長期效應(yīng)。
　　 材料和方法：
　　 1.采用卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)結(jié)合胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(intracytopla

2、smic sperminjecTiO2，ICSI)建立小鼠IVM技術(shù)平臺。比較IVM卵母細(xì)胞與體內(nèi)成熟(invivo maturaTiO2，VVM)卵母細(xì)胞受精率，卵裂率，胚胎發(fā)育率。
　　 2.檢測IVM對出生后子一代生長發(fā)育及相關(guān)行為學(xué)影響
　　 1)比較IVM和VVM組移植后妊娠率，妊娠周期，子代出生率，子代存活率及雌雄比的差異。
　　 2)生長曲線及器官發(fā)育檢測：以IVM子代為研究對象，以VVM子代為對照

3、組，同時設(shè)立自然妊娠組為陰性對照，自出生第1天起至第10周性成熟期測量不同性別各組小鼠體重變化；于10d，3w，10w取小鼠各器官，測量各組器官重量所占體重百分比。
　　 3)發(fā)育期生殖能力檢測：利用SCA(Sperm Class Analyzer)動物精子分析統(tǒng)檢測10w雄鼠精子活力；雌鼠自6w起連續(xù)3周做陰道圖片，觀測動情周期；性成熟期各組雌雄小鼠兩兩1：1自然交配，比較其生育能力。
　　 4)學(xué)習(xí)認(rèn)知能力檢測：水迷

4、宮實驗比較各組小鼠潛伏期及穿臺次數(shù)。
　　 3.檢測IVM對出生后子二代生長發(fā)育及相關(guān)行為學(xué)影響
　　 1)性成熟期各組子一代雌雄小鼠兩兩1：1自然交配，比較各組妊娠率，子二代存活率及雌雄比的差異。
　　 2)生長曲線及器官發(fā)育，發(fā)育期生殖能力檢測，學(xué)習(xí)認(rèn)知能力檢測同子一代。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過優(yōu)化IVM條件，成功建立小鼠IVM技術(shù)平臺。
　　 2.IVM組卵母細(xì)胞受精率、卵裂率

5、及胚胎發(fā)育率均較VVM組顯著性降低。
　　 3.IVM對出生后子一代生長發(fā)育及相關(guān)行為學(xué)影響
　　 1)IVM子一代出生率及存活率均較VVM組顯著性降低。
　　 2)IVM組子一代體重較自然妊娠組顯著性升高，其腦組織器官比重較自然妊娠組顯著性降低，但與VVM組比較無顯著性差異。
　　 3)IVM組子一代產(chǎn)仔數(shù)量顯著性高于自然妊娠組，但與VVM組比較沒有顯著性差異。各組精子活力相關(guān)指數(shù)、動情周期無顯著性差異

6、。
　　 4)水迷宮實驗示各組潛伏期及穿臺次數(shù)無顯著性差異。
　　 4.IVM對出生后子二代生長發(fā)育及相關(guān)行為學(xué)影響
　　 1)IVM組子二代存活率較其余各組顯著性降低。
　　 2)IVM組子二代體重及器官比重與其余各組比較均無顯著性差異。
　　 3)子二代各組精子活力相關(guān)指數(shù)、動情周期無顯著性差異。
　　 4)水迷宮實驗示各組潛伏期及穿臺次數(shù)無顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　

7、　 1.IVM影響卵母細(xì)胞受精、卵裂及胚胎發(fā)育。
　　 2.IVM子一代出生率及存活率降低，體重增大，器官比重降低，表明IVM可影響子一代生長發(fā)育。
　　 3.IVM影響子一代生育能力及子二代存活率，提示IVM存在婚配風(fēng)險性。
　　 4.IVM的影響涵蓋卵母細(xì)胞、胚胎直至出生后子一代甚至子二代，是多方面多層次的，具體效應(yīng)還有待進(jìn)一步考證。
　　 第二部分：IVM對子代腦組織全基因組表達(dá)譜的影響
　

8、　 目的：通過研究IVM對子代腦組織全基因組表達(dá)譜的影響，闡明其對基因表達(dá)影響的差異程度及涉及的主要方面，并分析差異基因在生長發(fā)育過程中的動態(tài)變化及子二代效應(yīng)，揭示IVM對子代神經(jīng)系統(tǒng)及腦發(fā)育的影響機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 1.應(yīng)用Affymetrix公司的Affymetrix mouse430小鼠基因組表達(dá)芯片，對IVM子代新生雄性小鼠及VVM子代新生雄性小鼠各三只進(jìn)行檢測，利用芯片顯著性分析（signifi

9、cance analysis of microarray，SAM），比較兩組標(biāo)本基因表達(dá)差異。
　　 2.通過分層聚類，GO(gene ontology)分類和信號通路(Pathway)分析等方法對差異基因進(jìn)行分析。
　　 3.選擇對芯片分析表達(dá)顯著性差異的重要基因，經(jīng)實時熒光定量RT-PCR驗證
　　 4.以驗證證實表達(dá)顯著性差異的基因為目標(biāo)基因，以IVM、VVM和自然妊娠出生（子一代）的10d齡（新生期），3

10、w齡（生長期）和10w齡（性成熟期）小鼠腦組織為對象，RT-PCR分析表達(dá)差異基因在不同性別小鼠的不同生長發(fā)育時期的變化。
　　 5.選取IVM子一代10w齡仍差異顯著的基因，利用RT-PCR檢測其在子二代小鼠腦組織的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.基因芯片結(jié)果顯示共196個差異基因，其中IVM組較VVM組基因表達(dá)上調(diào)158個，下調(diào)38個，對差異基因進(jìn)行無監(jiān)督分層聚類，可完全區(qū)分IVM組和VVM組子代。

11、>　　 2.GO分析顯示差異基因包括神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)分化相關(guān)基因。
　　 3.Pathway分析發(fā)現(xiàn)10條主要的差異信號通路，差異最顯著的是神經(jīng)活動配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interacTiO2)通路。
　　 4.熒光定量RT-PCR檢測神經(jīng)活動配體-受體相互作用通路中8個基因及與腦發(fā)育相關(guān)的5個基因表達(dá)水平，與芯片結(jié)果一致。
　　 5.IVM小鼠不同生長發(fā)

12、育時期腦組織基因表達(dá)動態(tài)變化研究顯示：上述13個基因在新生小鼠表達(dá)上調(diào)；3w齡時部分基因表達(dá)歸于正常；到10w齡，除雄鼠Neurodl和Pax6表達(dá)上調(diào)，雌鼠Agtr2基因表達(dá)上調(diào)，Pax6基因表達(dá)下調(diào)外，其余基因表達(dá)均趨于正常。
　　 6.RT-PCR分析IVM子二代小鼠腦組織基因表達(dá)，結(jié)果顯示，Agtr2在IVM組子二代雄性小鼠仍表現(xiàn)為表達(dá)上升，而Neurodl和Pax6在IVM組子二代表達(dá)趨于正常。
　　 結(jié)論：<

13、br>　　 1.IVM可影響子代腦組織基因表達(dá)，涉及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)分化相關(guān)基因。
　　 2.IVM子代腦組織中大部分差異表達(dá)基因會隨生長發(fā)育逐步糾正，至性成熟期仍有部分未得到糾正而繼續(xù)異常表達(dá)。
　　 3.部分基因差異表達(dá)延續(xù)到子二代，并出現(xiàn)性別差異，提示IVM子代可能會有神經(jīng)行為學(xué)改變風(fēng)險。這些改變可能與某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，仍需大量研究評估IVM遠(yuǎn)期安全性及潛在發(fā)病風(fēng)險。
　　 第三部分：IVM對子代腦

14、組織印記基因差異表達(dá)及調(diào)節(jié)的影響
　　 目的：研究IVM對子代腦組織印記基因表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制，評估IVM對子代印記基因甲基化調(diào)控改變的風(fēng)險。
　　 材料和方法：
　　 1.本研究以IVM子代為研究對象，以VVM子代為對照，同時設(shè)自然妊娠子代為陰性對照，結(jié)合基因芯片，篩選可能存在差異的印記基因進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測。
　　 2.熒光定量RT-PCR檢測印記基因表達(dá)關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶(Dnmt1，Dnmt3

15、a，Dnmt3b，Dnmt31)的表達(dá)變化。
　　 3.通過亞硫酸氫鹽測序PCR(bisulfite-sequencing PCR，BSP)檢測差異印記基因CpG島的甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 1.芯片共包含了70個印記基因，放寬條件，降低Fold值至1.4，篩選到8個印記基因，分別是H19，Igf2，Kcnqlot1，Mest，Peg3，Ube3a，Snrpn和Peg12。
　　 2.對IVM，V

16、VM和自然妊娠三組子代進(jìn)行上述8個基因的實時熒光定量PCR驗證，結(jié)果顯示，IVM子代中，H19表達(dá)下調(diào)，Kcnqlot1表達(dá)上調(diào)，其余6個基因表達(dá)水平三組間無顯著性差異。
　　 3.Dnmtl表達(dá)水平IVM組較VVM及自然妊娠組顯著性升高；Dnmt3a表達(dá)水平IVM及VVM組均較自然妊娠組顯著性升高，而Dnmt3b及Dnmt31表達(dá)水平三組間無顯著性差異。
　　 4.采用BSP法分析H19基因啟動子區(qū)CpG島的12個Cp

17、G位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H19三組均呈中等程度甲基化，三組間甲基化狀況基本相似，IVM組甲基化程度較其他兩組高，但無顯著性差異，部分母源性表達(dá)位點出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，而在其他兩組均未發(fā)現(xiàn)；BSP法分析了Kcnqlot1基因啟動子區(qū)CpG島的20個CpG位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三組均呈中等程度甲基化，三組間甲基化狀況基本相似，IVM組甲基化程度較其他兩組低，但無顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.IVM可影響子代腦組織印記基因H19及Kc

18、nqlotl表達(dá)水平。
　　 2. IVM子代H19差異甲基化區(qū)CpG島甲基化水平未見明顯差異，但有部分母源性甲基化，可能與Dnmt1及Dnmt3a表達(dá)異常有一定關(guān)系，其相互作用從而影響基因表達(dá)。
　　 3.IVM子代Kcnqlot1差異甲基化區(qū)CpG島甲基化水平未見明顯差異，可能有其他調(diào)節(jié)方式影響該印記基因的表達(dá)。
　　 4.IVM子代腦組織中的印記基因表達(dá)差異，表明IVM過程可能通過不同方式干擾印記的建立與維