溪黃草提取物抗免疫肝損傷作用機(jī)理研究.pdf

1、病毒性肝炎是一種全世界常見病，我國屬流行嚴(yán)重地區(qū)，慢性肝炎的流行嚴(yán)重影響了人民群眾的身體健康。由于慢性乙型肝炎是引起肝硬化和原發(fā)性肝癌的主要原因，因此在全世界范圍內(nèi)，開展慢性肝炎防治新手段的研究一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。 目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對慢性肝炎的治療藥物主要分為三類：①抗病毒藥物，主要有干擾素和幾種核苷類類似物，兩大類藥物各有優(yōu)勢，也各有缺點(diǎn)，前者療效肯定，血清轉(zhuǎn)換率較高，有確切的治療終點(diǎn)，但使用不方便，副作用較大；后者服用方便，

2、療效可靠，但需要長期用藥，治療終點(diǎn)不確切，易耐藥；②免疫調(diào)節(jié)治療，包括胸腺肽、治療性疫苗等，前者調(diào)節(jié)免疫，增強(qiáng)機(jī)體的免疫清除能力，從而實(shí)現(xiàn)抑制甚至清除病毒的作用，可聯(lián)合核苷類似物或干擾素進(jìn)行治療，但療效頗有爭議，目前尚無可供臨床使用的用于治療的HBV感染的治療性疫苗；③護(hù)肝降酶藥物，如聯(lián)苯雙酯、五味子制劑及某些中草藥，這類藥物對降低血清轉(zhuǎn)氨酶，退黃疸有一定效果，其中尤以我國自行研發(fā)的聯(lián)苯雙酯效果為優(yōu)，但容易出現(xiàn)停藥后反跳，此類藥物副作用

3、少，可用于肝炎的輔助性治療。 由于肝炎病毒復(fù)制的特殊性，導(dǎo)致抗病毒劑的尋找在全世界都是一個難題。機(jī)體自身的免疫應(yīng)答在病毒性肝炎的發(fā)展機(jī)制中具有非常重要的意義，乙型肝炎病毒對肝細(xì)胞的損傷主要是由免疫反應(yīng)引起的，除抗病毒外，促進(jìn)損傷肝細(xì)胞的修復(fù)以及尋找針對性較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)藥物，也是該類疾病治療藥物研究的方向之一。從中草藥中研究開發(fā)保肝藥物是一極具前景的領(lǐng)域，目前由日本從甘草中研制開發(fā)的甘草甜素類藥物和歐洲所開發(fā)的水飛薊素，是國際天然

4、藥物市場上重要的保肝產(chǎn)品，我國自建國以來，在抗肝炎藥物的研發(fā)領(lǐng)域，一直投入了大量的人力和物力，致力于在中草藥中尋找和研發(fā)具有抗病毒活性的藥物以及具有保肝效果的天然藥物制劑，然而由于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)未明及作用機(jī)理不清楚，該類藥物的研發(fā)基本上處于低水平重復(fù)狀態(tài)，至今未有高效低毒的新藥問世。 進(jìn)行抗肝炎藥物的篩選及作用機(jī)理研究，建立盡可能的符合臨床病理過程的動物模型尤為關(guān)鍵。由于機(jī)體自身對肝炎病毒的免疫反應(yīng)引起的肝細(xì)胞損傷是慢性肝炎的

5、主要病理機(jī)制，故建立免疫肝損傷模型是研究治肝炎新藥的較理想模型。近年來運(yùn)用刀豆蛋白A誘發(fā)的小鼠特異性肝損傷，其致病特點(diǎn)與我們目前所知的人類病毒性肝炎的病理機(jī)制有許多的相似之處，是典型的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性肝損害，因此本研究選擇CoIA誘導(dǎo)免疫性肝損傷模型，來探討溪黃草治療免疫肝損傷的作用機(jī)理。 溪黃草作廣東民間習(xí)用草藥，具有清熱利濕，退黃、涼血散瘀等之功效，經(jīng)資源學(xué)調(diào)查證實(shí)市場上其主流品種為狹基線紋香茶菜。既往的研究結(jié)果提示，狹基

6、線紋香茶菜的水提物和醇提物均具有保肝、抑菌、抗炎等作用。進(jìn)而對水提物進(jìn)行了免疫肝損傷保護(hù)作用的研究，發(fā)現(xiàn)對ConA誘導(dǎo)的免疫肝損傷具有顯著的保護(hù)作用。我校熱研所等研究單位，近幾年對溪黃草展開了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)其水提物及醋酸乙酯部位體內(nèi)均可以抑制鴨乙肝病毒模型DHBV-DNA的量，體外對2.2.15細(xì)胞表達(dá)乙肝病毒(HBV)抗原有抑制作用。本研究正是基于以上的背景立題，在既往的工作基礎(chǔ)上，深入探討溪黃草之主流品種，狹基線紋香茶菜的提取物

7、，對免疫肝損傷小鼠的血清酶學(xué)及病理組織學(xué)的影響；以及研究溪黃草提取物對免疫肝損傷中的重要炎性介質(zhì)TNF-α、ICAM-1基因表達(dá)的影響，及對TNF-α、LCAM-1 的上游信號分子NF-κB的表達(dá)的影響。以闡明溪黃草護(hù)肝作用的可能機(jī)制，并為將溪黃草開發(fā)為現(xiàn)代化的高效低毒的抗肝炎治療藥物提供基礎(chǔ)研究資料。 一、溪黃草提取物對免疫肝損傷小鼠血清酶學(xué)及病理組織學(xué)檢查的影響 目的：建立ConA誘導(dǎo)的免疫肝損傷模型，并在此基礎(chǔ)上研

8、究溪黃草提取物對免疫肝損傷小鼠血清酶學(xué)及病理組織學(xué)的影響。 方法：將Balb/c小鼠于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)三天后，隨機(jī)分成5組：正常對照組，模型對照組，陽性對照組(吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽，PDTC組)，中藥治療組 (溪黃草提取物大、小劑量組)。從實(shí)驗(yàn)第1d開始，分別灌胃給予正常對照組、模型對照組及陽性對照組無菌生理鹽水，中藥治療大、小劑量組分別每日給予溪黃草提取物 9.2g/kg，4.1g/kg，連

9、續(xù)灌胃7d。各組除正常對照組、陽性對照組外，分別于第7d灌胃后半小時尾靜脈注射ConA 25mg/kg以造成免疫肝損傷模型，陽性藥組在ConA注射前半小時腹腔注射PDTC 120mg/kg。于造模后第4h、8h分別取血，檢測血清中ALT、AST水平以及進(jìn)行肝臟病理組織學(xué)檢查，并留取肝組織作相應(yīng)處理后作RT—PCR及免疫組織化學(xué)的檢測。 血清酶學(xué)及病理組織檢查結(jié)果顯示：(1)ConA能成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫性肝損害：表現(xiàn)為模型組血清

10、ALT、AST水平顯著高于正常對照組 (P<0.01)；而病理組織學(xué)顯示模型組4h肝細(xì)胞胞漿疏松，染色整個變淺，肝細(xì)胞索排列破壞，肝竇瘀血普遍，匯管區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤，可見局部點(diǎn)、片狀壞死。8h后，細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)等略有改善，但出現(xiàn)較多嗜酸性變的肝細(xì)胞，胞漿為深紫紅色，核固縮；(2)溪黃草治療大劑量組可以顯著降低血清中ALT、AST的水平，與模型對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)，小劑量組血清ALT、AST的水平與模型組無顯著性差異；

11、溪黃草大劑量組的4h和8h組織學(xué)檢查結(jié)果也提示，肝臟損傷明顯減輕于模型組，肝索大部分的結(jié)構(gòu)還在，肝細(xì)胞腫脹，部分細(xì)胞胞質(zhì)疏松，肝竇的瘀血減輕，有少量的炎癥細(xì)胞浸潤，可散在點(diǎn)狀壞死和嗜酸性變，8h出現(xiàn)較多嗜酸性樣變，但明顯少于模型組；小劑量組肝損傷較重，肝細(xì)胞索排列破壞，大部分細(xì)胞腫脹，可見片狀壞死，8h細(xì)胞排列稍改善，但嗜酸性樣變增多，肝竇瘀血嚴(yán)重。 結(jié)論：溪黃草提取物可以保護(hù)小鼠免于ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損害，具有降酶護(hù)肝的

12、作用。 二、溪黃草提取物對免疫肝損傷小鼠 TNF-α mRNA 和蛋白表達(dá)水平的影響 目的：研究溪黃草提取物對免疫肝損傷機(jī)制中腫瘤壞死因子 (TNF-α)基因表達(dá)的影響。 方法：免疫組織化學(xué)法檢測了溪黃草提取物對免疫肝損傷小鼠 TNF-α蛋白的表達(dá)，半定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng) (RT—PCR)法檢測溪黃草提取物對免疫肝損傷小鼠TNF-αmRNA 的表達(dá)。 結(jié)果：ConA 損傷后，小鼠肝組織的TNF-α蛋白

13、及mRNA水平明顯升高，溪黃草提取物大劑量組可以降低升高的 TNF-α蛋白的表達(dá)，同時可以下調(diào)免疫肝損傷小鼠升高的 TNF-α mRNA 的表達(dá)，小劑量組效果不明顯，小鼠肝組織的 TNF-α蛋白及mRNA水平與模型組比較無顯著性差異。 結(jié)論：溪黃草提取物在轉(zhuǎn)錄水平即對免疫肝損傷中的炎性細(xì)胞因子TNF-α起抑制作用。 三、溪黃草提取物對免疫肝損傷小鼠 ICAM-1mRNA 和蛋白表達(dá)水平的影響 目的：研究溪黃草提取

14、物對免疫肝損傷機(jī)制中細(xì)胞粘附因子(ICAM-1)基因表達(dá)的影響。 方法：免疫組織化學(xué)法檢測了溪黃草提取物對免疫肝損傷小鼠ICAM-1蛋白的表達(dá)，RT—PCR 法檢測溪黃草提取物對免疫肝損傷小鼠ICAM-1 mRNA 的表達(dá)。 結(jié)果：細(xì)胞粘附因子參與了ConA 小鼠肝損害的病理進(jìn)程，小鼠肝組織的ICAM-1 蛋白及 mRNA 表達(dá)均明顯增強(qiáng)，而溪黃草提取物大劑量組可以降低損傷小鼠 ICAM-1蛋白的表達(dá)，同時可以下調(diào)免疫肝

15、損傷小鼠的 ICAM-1mRNA 的表達(dá)：小劑量組效果不明顯，小鼠肝組織的ICAM-1 蛋白及 mRNA 水平與模型組比較無顯著性差異。 結(jié)論：溪黃草提取物通過抑制ICAM-1 基因的轉(zhuǎn)錄來下調(diào)免疫肝損傷中ICAM-1的表達(dá)。 四、溪黃草提取物對免疫肝損傷小鼠 NF-κ B蛋白表達(dá)水平及核轉(zhuǎn)位的影響 目的：研究溪黃草提取物對免疫肝損傷中核轉(zhuǎn)錄因子 (NF-κ B)的影響。 方法：免疫組織化學(xué)檢測了溪黃草提