HPV16L1-E7 L2-E7疫苗構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達(dá)和HPV16L1-E7疫苗的免疫原性的初步研究.pdf

1、宮頸癌是女性死于惡性腫瘤的重要因素。研究證明90％左右的宮頸癌的組織可以檢測(cè)到HPV16亞型，HPV16型與鱗癌有著密切關(guān)系，而90％的宮頸癌為鱗癌，所以HPV16是女性宮頸癌發(fā)病的主要原因。
　　 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是現(xiàn)目前廣泛應(yīng)用的異源蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)，其具有穩(wěn)定性好、表達(dá)高效、分泌量大、規(guī)模化容易和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，且具有糖基化等翻譯后修飾功能。
　　 本研究主要開(kāi)展了以下幾方面工作：①克隆HPV16 L1/E7

2、和L2/E7基因及構(gòu)建質(zhì)粒pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L2/E7；②將構(gòu)建成功的真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L2/E7轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選穩(wěn)定高效分泌表達(dá)菌株；③在80L發(fā)酵罐規(guī)模下建立了HPV16L1/E7發(fā)酵工藝；④研究該疫苗的免疫原性和抗腫瘤效果。主要研究結(jié)果如下：
　　 一、HPV16L1、L2和E7基因的克隆及質(zhì)粒pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L2/E7的構(gòu)建
　　

3、利用特異性引物，通過(guò)PCR方法獲得編碼HPV16L1、L2和E7蛋白的基因序列。將獲得的基因序列克隆到pPIC9k載體上，建立了pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L2/E7克隆質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序鑒定方法驗(yàn)證，證明克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 二、穩(wěn)定高效分泌表達(dá)畢赤酵母菌種的篩選與鑒定
　　 1.畢赤酵母感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化(按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)操作進(jìn)行)。確定構(gòu)建成功的pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L1

4、/E7表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)相應(yīng)酶切鑒定和測(cè)序證實(shí)后，線性化重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115。
　　 2.重組畢赤酵母菌種的篩選。在MM和MD培養(yǎng)基上確定其生長(zhǎng)表型；然后用2.0mg/ml濃度的G418篩選高拷貝的菌株，提取其基因組DNA作模板，進(jìn)行PCR鑒定。
　　 3.HPV16L1/E7和HPV16L2/E7的表達(dá)與鑒定。取PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子于28℃搖床培養(yǎng)擴(kuò)增，0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，分別用SDS-PAGE、Wes

5、tern blot檢測(cè)了表達(dá)蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示只有HPV16-L1/E7融合蛋白得到成功表達(dá)，WESTERN-BLOT顯示在出現(xiàn)正確的特異條帶并有較好的抗原性，與推導(dǎo)的蛋白條帶大小一致，說(shuō)明在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功的表達(dá)了pPIC9k-L1/E7蛋白。而pPIC9k-L2/E7蛋白卻未表達(dá)成功。經(jīng)測(cè)定重組HPV16L1/E7蛋白疫苗表達(dá)量為50ng/ul。
　　 4.外源蛋白表達(dá)單一實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。畢赤酵母對(duì)外源蛋白的表達(dá)受很多因

6、素的影響，但主要是pH值、甲醇濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，所以本研究從這三個(gè)方面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)在pH值為6.0、誘導(dǎo)時(shí)間為60小時(shí)和甲醇濃度為0.5％的時(shí)候表達(dá)最為顯著。
　　 三、融合蛋白的免疫原性和抗腫瘤方面進(jìn)行了初步研究
　　 1.為檢測(cè)HPV16-L1/E7融合蛋白的免疫原性，實(shí)驗(yàn)中用純化的融合蛋白免疫C57BL/6小鼠，然后檢測(cè)其誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果說(shuō)明該蛋白疫苗具

7、有很好的免疫性，產(chǎn)生了能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間和較高滴度的抗血清，表明能夠誘發(fā)小鼠機(jī)體的體液免疫。
　　 2.為研究疫苗的預(yù)防性效果，本研究先對(duì)小鼠注射蛋白疫苗免疫，然后荷瘤。結(jié)果顯示，免疫了重組蛋白疫苗的那組，腫瘤生長(zhǎng)緩慢質(zhì)量小，平均腫瘤質(zhì)量為2.08g；而佐劑對(duì)照組生長(zhǎng)快質(zhì)量大，平均質(zhì)量為2.99g。
　　 3.對(duì)小鼠的治療性免疫效應(yīng)中，本研究先對(duì)小鼠荷瘤，等腫瘤長(zhǎng)到一定大小，然后給小鼠注射疫苗免疫。結(jié)果顯示小鼠免疫了重組蛋