HCV E1-E2-gAD融合DNA疫苗的構(gòu)建與免疫原性研究.pdf

1、背景：
　　 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是慢性肝炎的主要誘因之一,在世界范圍內(nèi)威脅著人類的健康。WHO估計全球約有2.2％約1.7億人感染HCV,60％的感染者將長期攜帶,而其中的20％可能發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌。國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國抗HCV陽性率平均為3.2％,約有4500萬感染者。目前對于HCV感染的處理措施依然有限,研究安全有效的丙型肝炎病毒疫苗,仍是目前攻克HCV的關(guān)鍵任務(wù)之一。HC

2、V的包膜糖蛋白E1,E2在天然狀態(tài)下被高度糖化,是構(gòu)成HCV病毒顆粒表面結(jié)構(gòu)的主要成分,與病毒吸附和進(jìn)入靶細(xì)胞過程有著重要的關(guān)系。二者作為病毒的重要組成部分,是最為重要的中和性抗原表位的所在,同時也是發(fā)生變異的集中區(qū)域,因此被普遍認(rèn)為是進(jìn)行HCV疫苗研究的關(guān)鍵靶標(biāo)[1-4]。
　　 脂聯(lián)素是由白色脂肪組織生成的一種糖蛋白質(zhì)激素,參與機體的脂糖代謝調(diào)節(jié),能夠超敏化胰島素的作用,對于HCV誘發(fā)胰島素抵抗從而引起肝脂肪變性有潛在的抑制

3、作用。脂聯(lián)素球形結(jié)構(gòu)域(gAD)是脂聯(lián)素的主要功能區(qū)域,其空間結(jié)構(gòu)與TNF-α相似,表達(dá)后可形成緊密的同源三聚體及多聚形態(tài)。同時由于在體內(nèi)的兩種受體之一AdipoR2在肝臟具有豐富的表達(dá),所以gAD可具備一定的肝靶向性。目前脂聯(lián)素在機體炎癥方面的作用并不明確,已有研究顯示其可能具有促進(jìn)和抑制炎癥的雙重功效[5-9]。
　　 目前采用基因工程進(jìn)行HCV E1和E2進(jìn)行體外表達(dá)的研究體系仍以原核表達(dá)為主,可能由于所生成的蛋白在修飾等

4、方面與病毒自然的宿主細(xì)胞存在差異,導(dǎo)致獲得經(jīng)充分修飾的HCV包膜糖蛋白比較困難。采用真核表達(dá)體系所面臨的主要問題便是產(chǎn)量過低,本研究試圖利用信號肽置換增強HCV包膜糖蛋白在真核細(xì)胞的表達(dá),而目前相關(guān)研究則并不多,其中主要是對E1E2自身的信號區(qū)域進(jìn)行互換或添加[10]。另外,為了研究脂聯(lián)素在抗原免疫中的作用,根據(jù)已有的相關(guān)研究,本實驗在已構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上加入gAD序列構(gòu)成系列重組DNA疫苗質(zhì)粒,通過與原質(zhì)粒對照獲得相關(guān)的免疫學(xué)數(shù)據(jù)

5、差異,用以評判g(shù)AD在疫苗以及診斷方面應(yīng)用的可行性。
　　 方法：
　　 本研究采用pVRC真核表達(dá)載體,分別構(gòu)建了攜帶HCV中國HeBei株(1b)E1和E2包膜糖蛋白基因去跨膜區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒及經(jīng)信號肽置換優(yōu)化后的表達(dá)質(zhì)粒,將其分別轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞,采用Western blot,Dot Blot以及GNA capture EIA等方法證實并分析比較了其表達(dá)。在上述實驗的基礎(chǔ)上,探索性地將脂聯(lián)素球部蛋白的基因加入載體,構(gòu)

6、成了兩組共八種抗原融合表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后采用Western Blot以及間接免疫熒光等方法進(jìn)行了基因表達(dá)的證實和比較后,選取相應(yīng)的高效正確表達(dá)質(zhì)粒對小鼠進(jìn)行了免疫,于0,3,6周采用皮內(nèi)電轉(zhuǎn)方式注射DNA進(jìn)行三針免疫,采用ELISPOT和ELISA等手段對免疫所誘發(fā)的細(xì)胞和體液免疫進(jìn)行了綜合評價。
　　 結(jié)果：
　　 一、HCV E1/E2高效分泌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與優(yōu)化.
　　 利用PCR方法亞克隆非跨

7、膜區(qū)段的HCV中國HeBei株(1b)的E1和E2包膜糖蛋白基因,將其分別插入pVRC載體構(gòu)建pVRC-HeBei-E1和pVRC-HeBei-E2兩種分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒。將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,經(jīng)Western blot驗證了其在細(xì)胞內(nèi)和胞外均能正確有效表達(dá)。經(jīng)信號肽分析后,設(shè)計選取了S-SD,S-FPA,S-Gluc三種信號肽基因?qū)⒃盘栯幕蜻M(jìn)行置換,經(jīng)Western blot證實其均能在293T細(xì)胞中獲得有效表達(dá),而且從經(jīng)

8、去糖基化和非還原處理的結(jié)果比較來看,信號置換并未引起目的蛋白條帶明顯的改變。表達(dá)樣品同時采用了Dot-Blot和GNA capttire EIA方法進(jìn)行了半定量,經(jīng)分析比較后認(rèn)為,S-TPA和S-Gluc信號序列置換的質(zhì)粒能獲得較原始信號肽序列獲得更為有效的表達(dá),兩者的表達(dá)效率相當(dāng),其中E1組的結(jié)果顯示,優(yōu)化后的目的蛋白表達(dá)效率能提高六倍以上。但是,盡管從軟件分析的數(shù)據(jù)上較其余信號肽更有優(yōu)勢,自行設(shè)計的S-SD序列卻僅獲得了優(yōu)于原始信號

9、肽的表達(dá)檢測結(jié)果。
　　 二.表達(dá)gAD的基因序列融入對HCV E1/E2 DNA疫苗免疫效果的影響利用重疊PCR將去跨膜區(qū)的HCV中國HeBei株(1b)E1和E2基因加入鉸鏈區(qū)后,分別與gAD蛋白基因序列進(jìn)行融合基因構(gòu)建,插入pVRC載體構(gòu)建獲得pVRC-HeBei-E1-gAD和pVRC-HeBei-E2-gAD兩組分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒。同時將gAD片段連入已構(gòu)建的E1/E2信號肽置換質(zhì)粒中,獲得了兩組共八種質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染2

10、93T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)分析。經(jīng)E1,E2,gAD特異性單克隆抗體的檢測證實了各自的表達(dá),并發(fā)現(xiàn)不同信號序列質(zhì)粒的表達(dá)結(jié)果與無gad序列質(zhì)?；疽恢?即s-Gluc和s-TPA信號肽的置入能使目的蛋白獲得更為有效的表達(dá)。
　　 為了研究gAD序列的融入對目的質(zhì)?？乖缘挠绊?同時觀察信號肽置換對免疫效果提升的效果,在前述研究的基礎(chǔ)上,實驗選取了原始信號肽的E2和E2-gAD質(zhì)粒以及S-Gluc信號肽的E2-gad質(zhì)粒進(jìn)行了小鼠的DNA

11、免疫。采用30μg/只的DNA免疫劑量,經(jīng)皮內(nèi)注射加卡鉗電極電轉(zhuǎn)的方式于0,3,6周免疫Balb/C小鼠,分次采血采用間接ELISA法檢測特異性的體液免疫反應(yīng)水平,最后取脾細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT檢測分析其所誘發(fā)的E2特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果顯示,在體液免疫效果方面單純采用DNA免疫的效果并不理想；而在細(xì)胞免疫方面,實驗組的ELISPOT計數(shù)(均大于50 SFC/106脾細(xì)胞)與對照組相比具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異,說明所采用的質(zhì)粒能有效誘

12、導(dǎo)小鼠針對E2的特異性細(xì)胞免疫；含gAD組質(zhì)粒的免疫效果相對于原始信號肽E2質(zhì)粒免疫組為優(yōu),而信號肽置換后的E2-gAD質(zhì)粒免疫組所獲得的計數(shù)提升與單純E2組相比則存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異,說明gAD基因的融入可在一定程度上增強疫苗的免疫原性,能夠更有效地誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)生,并且高效的信號肽的置入可更為有效地體現(xiàn)這一效果。
　　 結(jié)論：
　　 本研究的主要結(jié)果和發(fā)現(xiàn)可總結(jié)為:
　　 1.在pVRC載體上成

13、功構(gòu)建了一系列HCV包膜糖蛋白E1、E2及其分別與脂聯(lián)素球部蛋白融合的真核表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)；
　　 2.在所構(gòu)建質(zhì)粒系統(tǒng)中探索了信號肽置換對目的蛋白表達(dá)的影響；
　　 3.初步證實了脂聯(lián)素球部蛋白的融合可在一定程度上增強疫苗的免疫原性。
　　 本課題的研究為進(jìn)行HCV的E1和E2包膜糖蛋白的抗原制備和疫苗研究創(chuàng)建了一個新的平臺。通過對目的蛋白進(jìn)行信號肽置換提升其表達(dá)效率,為其在真核表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行大規(guī)模制備提供了