MIP-1α和Flt31基因佐劑聯(lián)合應(yīng)用對HPV16E7 DNA疫苗免疫效果的研究.pdf

1、目的： 人乳頭瘤病毒(human papilloma，viruses，HPV)可使感染部位產(chǎn)生良性和惡性病變，根據(jù)其致瘤性的不同可分為低危型和高危型兩大類。高危型別的HPV感染與子宮頸癌的發(fā)生關(guān)系十分密切，其中50％的子宮頸癌與高危型別中的HPV16感染有關(guān)。目前手術(shù)和放化療是子宮頸癌臨床采用的主要方法，為防止疾病復(fù)發(fā)，術(shù)后采用免疫治療成為當(dāng)前研究的熱點。DNA疫苗為防止HPV16感染而引起子宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)提供了可能性。目前子宮

2、頸癌基因疫苗的研究通常以HPV的早期蛋白E6/E7作為靶抗原，該疫苗雖能在一定程度上增強特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lympho-cyte，CTL)反應(yīng)，但不能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CD4<'+>T輔助細(xì)胞，使疫苗的應(yīng)用受限。因此如何增強抗原的免疫原性成為研究的熱點。樹突細(xì)胞(dendritic cells，DCs)作為機體最重要的抗原提呈細(xì)胞(Ag-presenting cells，APCs)在誘發(fā)免疫應(yīng)答過程中處于核心

3、地位。DCs在抗原產(chǎn)生部位數(shù)量的不足，限制了抗原被APCs的提呈，降低了抗原的免疫原性。應(yīng)用DCs特異性招募因子和特異性生長因子提供雙重信號來增加抗原產(chǎn)生部位DCs的數(shù)量，為HPV16E7 DNA疫苗的進(jìn)一步研究提供了新思路。 巨噬細(xì)胞炎性蛋白 1α(macroptlage inflammatoryprotein-1α，MIP—1α)最早是在經(jīng)LPS(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)的

4、分子量為8000～14000的趨化因子。當(dāng)其與受體CCR1、CCR4、CCR5結(jié)合后，可趨化包括單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫效應(yīng)細(xì)胞，并對單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞有免疫調(diào)節(jié)作用。此外，MIP-1α可誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，是一種激活Th1型免疫反應(yīng)的有效佐劑。酪氨酸激酶受體3配體(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)lt31)是1993年首次發(fā)現(xiàn)并被成功克

5、隆的一種早期造血細(xì)胞生長因子，它與干細(xì)胞因子(SCF)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)有部分同源性。骨髓基質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞可表達(dá)有功能的Flt3l蛋白，當(dāng)其與酪氨酸激酶受體3(fms-like tyrosinekinase 3 receptor,.Flt3R)結(jié)合后，使酪氨酸激酶被激活，講而發(fā)揮生物學(xué)作用。由于成熟DCs不表達(dá)Flt3R，不成熟DCs才表達(dá)Flt3R，因此Flt3l可以選擇性地擴增DCs前體細(xì)胞數(shù)量，并促進(jìn)其成熟，使誘

6、導(dǎo)衍生的DCs形態(tài)呈典型的樹突狀，攝取和加工抗原的能力明顯加強，是體內(nèi)外刺激DCs生成的最強大和最重要的細(xì)胞因子之一。 本研究構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/F1t31，將其與pcDNA3/HPV16E7基因疫苗共注射C57BL/6小鼠，觀察脾臟CTL的殺傷作用及小鼠抵抗TC-1腫瘤細(xì)胞攻擊的能力。 方法： (1)從燙傷小鼠脾臟提取總RNA，用RT-PCR法擴增MIP-1α片斷。用P

7、CR法從攜帶HPV16E7的質(zhì)粒中擴增HPV16E7片段； (2)將兩種基因的擴增產(chǎn)物分別與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,接種含氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)的2YT培養(yǎng)基，挑取菌落、提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測序篩選重組子； (3)經(jīng)酶切鑒定和測序確認(rèn)后，從這兩種克隆載體切取目的基因片段。將目的基因片段MIP-1α和HPV16E7分別與經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切的pcDNA3載體連接，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒p

8、cDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPVl6E7； (4)從攜帶Fit31的質(zhì)粒切取Flt31目的基因片段，與經(jīng)相同的內(nèi)切酶處理的pcDNA3載體芝接，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3/Flt31，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種含Amp的2YT培養(yǎng)基，挑取菌落、提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測序篩選陽性重組子； (5)用堿裂解法從轉(zhuǎn)化的DH5α大腸桿菌中大量提取質(zhì)粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/HPV16E7、pc

9、DNA3/Flt31和pcDNA3，用聚乙二醇(PEG)沉淀法進(jìn)行純化； (6)動物實驗：將6～8周齡雌性C57BL/6小鼠隨機分為5組，每組14只；5組分別為pcDNA3組、pcDNA3/HPV16E7組、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合組、pcDNA3/Flt31和pcDNA3/HPV16E7混合組、pcDNA3/Flt31、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合組。純化后的

10、質(zhì)粒以生理鹽水稀釋，股四頭肌肉注射免疫小鼠，每次每只小鼠接種每種質(zhì)粒50 μg，不足150 μg時用pcDNA3質(zhì)粒補足，每3周免疫1次，共免疫3次；術(shù)次免疫后兩周每組隨機抽取6只小鼠，無菌條件下取出脾臟，用CCK-8試劑盒檢測其對TC-1靶細(xì)胞的特異性殺傷能力。其余小鼠在腹股溝皮下注射5×10<'4>個TC-1細(xì)胞使小鼠成瘤，一周后隔日觀察小鼠成瘤情況，一個月后每周觀察一次，記錄腫瘤生長情況。小鼠成瘤后隨機抽取不同處理組的腫塊，制備石

11、蠟切片，HE染色，觀察各組小鼠腫塊組織細(xì)胞的病理學(xué)形態(tài)。 結(jié)果： (1)RT-PCR法擴增出MIP-1α基因片段，其長度與預(yù)期值相符； (2)成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEM-T/HPV16E7和pGEM-T/MIP-1α，DNA測序證實目的基因序列與Genebank登錄序列相同； (3)基因片段插入pcDNA3后酶切結(jié)果證實成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/HPV16E7和p

12、cDNA3/Flt31： (4)免疫小鼠對TC-1靶細(xì)胞的特異性殺傷百分率分別為：pcDNA3/FIt31、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合組88.83％，pcDNA3/Flt31和pcDNA3/HPV16E7混合組76.00％，pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合組76.33％，pcDNA3/HPV16E7組79.00％，pcDNA3組65.33％。單因素方差分析提示5組之間

13、有明顯差異(P<0.01)：兩兩比較可得：pcDNA3組的特異性殺傷百分率明顯低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；pcDNA3/Flt31、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合組的特異性殺傷百分率高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；pcDNA3/Flt31和DcDNA3/HPV16E7混合組、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合組及pcDNA3/HPV16E7組三組

14、間無統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)； (5)用TC-1腫瘤細(xì)胞攻擊小鼠后16天，pcDNA3組小鼠全部長出腫瘤，而pcDNA3/Flt31、pcDNA3/MIP-1α齊口pcDNA3/HPV16E7三種質(zhì)?；旌辖M的成瘤率僅為12.5％，明顯低于其他組，統(tǒng)計學(xué)分析示5組之間成瘤率差異有顯著性(P=0.005)。兩兩比較示：pcDNA3/Flt31、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合組與pcDNA3組之間有統(tǒng)計

15、學(xué)差別(P=0.00)；pcDNA3/Flt31、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合組與pcDNA3/HPV16E7組之間有統(tǒng)計學(xué)差別(P=0.041)；pcDNA3/Flt31、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合組與pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合組兩者之間有統(tǒng)計學(xué)差別(P=0.041)：其余各組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。60天后各組之間成瘤率的

16、差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.229)； (6)小鼠腫塊組織的病理學(xué)觀察示：典型的腫瘤細(xì)胞形態(tài)。 結(jié)論： (1)用燙傷法成功克隆了小鼠MIP-α基因片段； (2)成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEM-T/HPV16E7和pGEM-T/MIP-1a； (3)成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/HPV16E7和pcDNA3/Flt31； (4)pcDNA3/FIt31、pcD