HPV16型mE7-CD40L DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文HPV16型mE7CD40LDNA疫苗的實(shí)驗(yàn)研究姓名：王慶勇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：許雪梅20070601中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩：學(xué)位論文中文摘要在全球范圍內(nèi)，宮頸癌是婦女因惡性腫瘤而死亡的第二位死因。世界范圍內(nèi)宮頸癌每年的新增病例50萬，死亡病例23萬，其中三分之二的病例是在發(fā)展中國家?，F(xiàn)在已經(jīng)明確持續(xù)性高危型HPV的感染是宮頸癌發(fā)生的重要原因，其中HPvl6感染是宮頸癌最主要致病因子。由H

2、PVl6感染發(fā)展引起的宮頸癌占宮頸癌總數(shù)的54％，而我國HPVl6陽性的宮頸癌占宮頸癌總數(shù)的796％。2006年MERCK公司生產(chǎn)由病毒主要外殼蛋白組成病毒樣顆粒疫苗已經(jīng)問世，該疫苗免疫后可有效誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的針對(duì)病毒顆粒表面Ll表位的中和抗體，因此可預(yù)防HPVl6、18、6及l(fā)l型病毒感染及感染相關(guān)疾病。由于病毒的外殼蛋白在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)量極低或不表達(dá)，因此目前尚未發(fā)現(xiàn)該疫苗對(duì)HPV感染及感染相關(guān)疾病的治療具有肯定作用。我國是宮

3、頸癌的高發(fā)區(qū)，因此研制研發(fā)針對(duì)HPVl6的免疫效果好而成本低的治療性疫苗意義重大。由于DNA疫苗具有安全性好、成本低、易于大量制備并可以反復(fù)應(yīng)用等優(yōu)勢(shì)，因此是適合我國國情的宮頸癌治療性疫苗的理想選擇。HPVl6E7是病毒的主要轉(zhuǎn)化基因，E7蛋白的持續(xù)高水平表達(dá)是腫瘤細(xì)胞惡性表型維持所必需的。E7蛋白是異源的病毒蛋白，屬于腫瘤特異性抗原，因此是宮頸癌免疫治療的理想靶抗原。為了消除E7蛋白的轉(zhuǎn)化活性并增強(qiáng)其免疫原性，本課題組對(duì)HPVl6疫苗

4、進(jìn)行了長期的探索研究，在前期工作中，我們通過聯(lián)合多種策略，包括基因切割重排、密碼子優(yōu)化、轉(zhuǎn)化活性位點(diǎn)的點(diǎn)突變等優(yōu)化改造了HPVl6E7基因。全基因合成法獲得了優(yōu)化改造后的E7基因，命名為mE7，并構(gòu)建了VRl012mE7重組質(zhì)粒，Westernblot證明該優(yōu)化基因在體外可正確表達(dá)。鑒于DNA疫苗的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低，免疫原性相對(duì)較差，因此mE7DNA疫苗的免疫原性需要進(jìn)一步增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)CD40配體(CD40ligandCD40L)與AP

5、C細(xì)胞特別是DC細(xì)胞表面的CD40相互作用，可促進(jìn)APC細(xì)胞的活化，增強(qiáng)APC細(xì)胞對(duì)抗原的加工呈遞，同時(shí)促進(jìn)DC細(xì)胞分泌IL12、TNFQ、IL8等細(xì)胞因子，并能促進(jìn)Thl類細(xì)胞活化。因此本研究將mE7與CD40L胞外區(qū)融合獲得mE7，CD40L融合基因，構(gòu)建該融合基因的真核表達(dá)質(zhì)筢2pVRl012HPVl6mE7／CD40L用于DNA疫苗研究。脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，Westernblot法對(duì)此重組基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。表