Bcl-xl基因?qū)ο跗这c誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的抑制作用.pdf

1、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，生理水平的NO是一種胞內(nèi)信使分子，對(duì)維持正常生理活動(dòng)有著重要的作用。高濃度的NO可產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化、腦血管病等。研究認(rèn)為，NO既可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可以引發(fā)細(xì)胞壞死，其中，凋亡又為主要途徑。因此選擇阻斷這種凋亡途徑從而改變疾病的進(jìn)程為本實(shí)驗(yàn)的根本目的。 基因治療即是指將治療基因遞送至細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)合成、最后由合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)生治療效應(yīng)。在

2、基因治療中，安全、有效的目的基因是關(guān)鍵。以往，抗凋亡基因研究多集中在Bcl—2上，但仍有研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入Bcl—2基因后并沒(méi)有抑制細(xì)胞凋亡，反而促進(jìn)了凋亡，他們認(rèn)為Bcl—2在不同細(xì)胞中凋亡的作用是有差別的。Bcl—xl的結(jié)構(gòu)和Bcl—2相似，在多種細(xì)胞中扮演抑制凋亡角色。國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者將其應(yīng)用于抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的各種研究中，并取得良好效果。Gonzalez—Garcia M等研究還發(fā)現(xiàn)Bcl—2在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)水平明顯較Bcl—

3、xl低很多，他們認(rèn)為，Bcl—x蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)神經(jīng)元方面可能發(fā)揮著重要的作用。因此，本研究選擇Bcl—xl基因作為研究對(duì)象，探索其對(duì)抗NO毒性的作用。 在模型的選擇上，考慮到人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的難接近性及原代培養(yǎng)神經(jīng)元的不可增殖性，研究中最終選擇人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH—SY5Y細(xì)胞做為工具。SY5Y是來(lái)源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)、生理和系列化功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，適合于作為神經(jīng)損傷細(xì)胞模型，被廣泛的用于中樞神經(jīng)

4、系統(tǒng)疾病研究。 本課題從人類胎盤組織中克隆出抗凋亡基因Bcl—xl，構(gòu)建出真核細(xì)胞表達(dá)載體pIRES2-EGFP/Bcl—xl，觀察它對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的SH—SY5Y細(xì)胞凋亡是否具有抑制作用，旨在探索Bcl—xl基因阻斷NO細(xì)胞凋亡損傷的途徑。 本課題內(nèi)容分為三部分： 第一章真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP/Bcl—xl的構(gòu)建和鑒定 目的：獲取人類抗凋亡基因Bcl—xl，構(gòu)建Bcl—xl真核表達(dá)質(zhì)粒。

5、 方法： 1、根據(jù)人Bcl—xl基因序列自行設(shè)計(jì)引物，從人類胚胎組織中提取總RNA，RT—PCR獲得Bcl—xl cDNA并擴(kuò)增后，TA克隆，與T載體連接，再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)菌，擴(kuò)增、提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。 2、選用SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切T載體質(zhì)粒，回收Bcl—xl片段，與含綠色熒光蛋白基因的pIRES2-EGFP質(zhì)粒連接，再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)菌，擴(kuò)增、提取質(zhì)粒，電泳、測(cè)序鑒定。 結(jié)果： 克

6、隆的Bcl—xl基因經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確，并成功與pIRES2-EGFP質(zhì)粒連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP/Bcl—xl。 第二章脂質(zhì)體對(duì)SH—SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及其毒性觀察 目的：觀察pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒借助Lipofectamine2000對(duì)SH—SY5Y細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及脂質(zhì)體對(duì)該細(xì)胞的毒性作用。 方法： 1、SH—SY5Y細(xì)胞于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培

7、養(yǎng)，在5％的CO2、37℃條件下培養(yǎng)。 2、利用Lipo fectamine2000在細(xì)胞匯合度70％時(shí)行轉(zhuǎn)染。將質(zhì)粒pIRES2-EGFP/Bcl—xl轉(zhuǎn)染入SH—SY5Y細(xì)胞。 3、轉(zhuǎn)染后48h，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀測(cè)質(zhì)粒在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果。 4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。 5、實(shí)驗(yàn)分三組：未轉(zhuǎn)染組、pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。

8、設(shè)定正常對(duì)照組細(xì)胞存活率為100％，其余各組光密度值與之相比得到各自的MTT細(xì)胞存活率。 結(jié)果： 1、以未轉(zhuǎn)染組MTT吸光度為對(duì)照，將pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組進(jìn)行MTT檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三者細(xì)胞存活率無(wú)明顯差別(P>0.05)。 2、顯微鏡下觀察，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，轉(zhuǎn)染效率約為63％。 第三章Bcl-xl基因?qū)ο跗这c誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡抑制作用的觀察

9、 目的：1、觀察硝普鈉對(duì)SH—SY5Y細(xì)胞的影響； 2、觀察Bcl—xl基因轉(zhuǎn)染入SH—SY5Y細(xì)胞后對(duì)硝普鈉作用的抑制。 方法： 1、硝普鈉(SNP)處理細(xì)胞：分別用不同濃度的(200umol/L、100umol/L、50umol/L、0umol/L)SNP作用SH—SY5Y細(xì)胞24 h，觀察各組濃度SNP對(duì)細(xì)胞的影響，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。并選取50 umol/L為實(shí)驗(yàn)濃度。 2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染并分組：

10、本實(shí)驗(yàn)設(shè)A：正常組、B： pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、C：pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，各組細(xì)胞生長(zhǎng)48h后，分別用50 umol/L SNP行藥物誘導(dǎo)。 3、SNP作用各組細(xì)胞24h后，Hoechst33258染色后觀察核染情況。 4、MTT比色法測(cè)定各組細(xì)胞活性，設(shè)定對(duì)照組為正常細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染，未加藥物，存活率為100％，余各組光密度值與之相比得到各自的MTT細(xì)胞存活率。 5、提取C組

11、轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后48h、轉(zhuǎn)染后72h、轉(zhuǎn)染后96h細(xì)胞總RNA，行RT—PCR法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Bcl—xl基因的mRNA轉(zhuǎn)錄情況。 6、提取C組轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后48h、轉(zhuǎn)染后72h、轉(zhuǎn)染后96h細(xì)胞總蛋白，用Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果： 1、光鏡下可以觀察到，隨著SNP濃度的升高，細(xì)胞突起回縮或斷裂，胞體固縮，呈圓點(diǎn)狀，網(wǎng)絡(luò)消失；流式細(xì)胞儀檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)

12、，凋亡率逐漸增高，并與濃度有正相關(guān)依賴性。與MTT結(jié)果相一致。 2、熒光顯微鏡下觀察，Hoechst33258染色后，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，著色均勻；而50umol/L SNP作用的細(xì)胞(包括未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)染色后發(fā)現(xiàn)約30％為凋亡細(xì)胞(與流式細(xì)胞結(jié)果相符)：呈核濃染，核固縮或?yàn)榈湫偷牡蛲鲂◇w；而pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組則凋亡細(xì)胞明顯減少，僅小部分胞核呈濃染狀，約10％左右。 3、在SN

13、P作用后，各組細(xì)胞行MTT檢測(cè)，pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率比正常組和pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組都要高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；而正常組和pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組之間存活率則無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。 4、RT—PCR結(jié)果：未轉(zhuǎn)染組有很微弱的電泳帶，轉(zhuǎn)染24h以后時(shí)間點(diǎn)電泳帶都明顯增強(qiáng)，而其中轉(zhuǎn)染后48h最強(qiáng)，均在700bp附近。 5、Western blott

14、ing結(jié)果：未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染24h組，轉(zhuǎn)染48h組可見(jiàn)弱爆光帶，強(qiáng)度一致，而轉(zhuǎn)染72h組，轉(zhuǎn)染96h組見(jiàn)較前三組明顯增強(qiáng)爆光帶，其中轉(zhuǎn)染72h組亮度最強(qiáng)，位于32KD左右。同時(shí)，各組間β—actin強(qiáng)度一致。 結(jié)論： 1、證實(shí)硝普鈉(SNP)對(duì)SH—SY5Y細(xì)胞具有凋亡效應(yīng)，而且與劑量有正相關(guān)依賴性。 2、Bcl—xl基因在SH—SY5Y細(xì)胞中有弱表達(dá)，將構(gòu)建質(zhì)粒pIRES2-EGFP/Bcl—xl轉(zhuǎn)染入該細(xì)胞后4