Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA對(duì)凋亡及軸突的影響.pdf

1、目的:篩選Aβ25-35誘導(dǎo)人源SH-SY5Y細(xì)胞損傷時(shí)差異性表達(dá)顯著的miRNA，并探討目標(biāo)miRNA對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡及軸突的影響。
　　方法:
　　1.基因芯片篩選并驗(yàn)證參與Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的miRNA:將細(xì)胞分成正常組和AD模型組。模型組加入Aβ25-35(40μmol/L)，正常組加入對(duì)應(yīng)量生理鹽水，培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞RNA。經(jīng)Agilent RNA6000 N

2、ano/Pico Assay法檢測(cè)各組所提RNA質(zhì)量合格后，使用HmiOA7.1基因芯片進(jìn)行miRNA基因芯片雜交程序。使用芯片熒光掃描儀掃描基因芯片熒光信號(hào)并轉(zhuǎn)換成影像數(shù)據(jù)，分析對(duì)比模型組與正常組的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)得出顯著變化的miRNA。根據(jù)miRNA的豐度以及變化程度，在上調(diào)和下調(diào)列表中分別選出差異表達(dá)明顯的3個(gè)miRNA，并對(duì)其進(jìn)行QPCR驗(yàn)證。
　　2.Hsa-miR-4487及hsa-miR-6845-3p靶基因GO

3、生物學(xué)過程富集分析以及KEGG信號(hào)通路分析:使用DAVID網(wǎng)站對(duì)miRwalk中多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(TargetScan，miRDB，miRWalk，miRanda)預(yù)測(cè)的hsa-miR-4487或hsa-miR-6845-3p靶基因交集進(jìn)行GO分析以及KEGG通路分析，得出受Aβ25-35調(diào)控的兩種miRNAs各自參與的生物信息學(xué)過程和通路。
　　3.Hsa-miR-4487、hsa-miR-6845-3p分別對(duì)Aβ25-35所致SH-

4、SY5Y細(xì)胞凋亡及軸突的影響:SH-SY5Y細(xì)胞分成正常組（mimics/inhibitor control），對(duì)照組(hsa-miR-4487 mimics/hsa-miR-6845-3p inhibitor)，模型組(Aβ25-35+mimics/inhibitor control)，干擾組(Aβ25-35+hsa-miR-4487 mimics/hsa-miR-6845-3pinhibitor)。轉(zhuǎn)染mimics或inhibito

5、r9小時(shí)后，模型組和干擾組加入Aβ25-35共培養(yǎng)48h，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hsa-miR-4487對(duì)細(xì)胞凋亡的影響以及激光共聚焦檢測(cè)hsa-miR-6845-3p對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞軸突損傷的影響。
　　結(jié)果:
　　1.參與Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的miRNA:MTT法檢測(cè)Aβ25-35對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示20μmol/L組細(xì)胞存活率與正常組相比顯著降低，給予40μmol/L Aβ2

6、5-35處理后細(xì)胞存活力下降至51.6％±7(P＜0.01)。將各組所提的合格RNA進(jìn)行miRNA基因芯片雜交程序，依據(jù)log2|Fold Change|≥0.585且P＜0.05的篩選條件，在人源SH-SY5Y細(xì)胞株中用對(duì)應(yīng)的2588種成熟的miRNA探針得出顯著上調(diào)的基因?yàn)?55種，顯著下調(diào)的基因數(shù)為50。選取變化明顯的6種miRNA進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示6種miRNA表達(dá)變化趨勢(shì)與基因芯片結(jié)果具有一致性。其中

7、給予Aβ25-35處理后下調(diào)最明顯且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的是miR-4487，而顯著性上調(diào)最明顯為miR-6845-3p。
　　2.Hsa-miR-4487及hsa-miR-6845-3p靶基因生物學(xué)過程通路富集分析:根據(jù)miRwalk和DAVID的預(yù)測(cè)顯示hsa-miR-4487多數(shù)靶基因參與了凋亡信號(hào)通路，而hsa-miR-6845-3p則參與了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，細(xì)胞粘附、增值，細(xì)胞大小調(diào)節(jié)，樹突棘生長(zhǎng)，軸突導(dǎo)向，長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)等。

8、　　3.Hsa-miR-4487、hsa-miR-6845-3p分別對(duì)Aβ25-35所致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡及軸突的影響:100nM hsa-miR-4487mimics濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)正常組，對(duì)照組，模型組，hsa-miR-4487mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡情況結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常情況下，只轉(zhuǎn)染hsa-miR-4487mimics組與轉(zhuǎn)染mimics control組細(xì)胞凋亡率都處于較低水平，而提前轉(zhuǎn)染hsa-miR-448

9、7mimics，再給予Aβ25-35，細(xì)胞凋亡率從模型組的54.74％顯著下降至21.11％(P＜0.05)。構(gòu)建hsa-miR-6845-3p inhibitor，激光共聚焦檢測(cè)正常組、對(duì)照組、模型組、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞軸突長(zhǎng)度以及SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中轉(zhuǎn)入hsa-miR-6845-3p inhibitor后與對(duì)照組相比，突起長(zhǎng)度有所增加，給予Aβ25-35損傷后，細(xì)胞突起減少變短，轉(zhuǎn)染hsa-miR-6845-3p inhi