龍須菜多糖偶聯(lián)蛋白的制備與免疫原性研究.pdf

1、龍須菜是粵東沿海地區(qū)大規(guī)模養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)海藻，在我國已經(jīng)成為繼海帶、紫菜、裙帶菜之后的第四大栽培海藻，資源日益豐富。龍須菜含有占干質(zhì)量31.05％的硫酸多糖。研究表明龍須菜多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗突變、抗氧化和增強(qiáng)免疫力等多種生理活性，有很好的研究開發(fā)價(jià)值。本文首次對龍須菜多糖的免疫原性進(jìn)行研究?？紤]到純多糖本身免疫原性較差，與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)可望提高其免疫原性，故采用多糖-蛋白偶聯(lián)的方法制備龍須菜多糖-BSA偶聯(lián)物，并對其

2、免疫原性進(jìn)行研究，以期為多糖疫苗開發(fā)和多糖抗原的研究提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外，本文還嘗試進(jìn)行龍須菜多糖對Hela細(xì)胞免疫抑制分子分泌作用的影響研究，具體內(nèi)容如下：
　　（1）龍須菜純多糖的制備：將經(jīng)過初步純化的龍須菜精多糖GLP經(jīng)DEAE C-52離子交換柱分離得到分子量不同的3個(gè)組分：GLP1、GLP2和GLP3，其中GLP2組分所占比例最大。經(jīng)檢測，3個(gè)組分在260nm和280nm波長處均無明顯吸收峰，僅含微量蛋白質(zhì)，說明樣

3、品中已基本除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，為較高純度多糖。
　?。?）龍須菜多糖與BSA的偶聯(lián)：通過調(diào)整偶聯(lián)劑CDAP的添加量，分別獲得不同取代度的多糖蛋白偶聯(lián)物：GLP2-BSA-L、GLP2-BSA-M、GLP2-BSA-H，GLP1-BSA-L和GLP3-BSA-L，其中GLP2-BSA-L、GLP2-BSA-M、GLP2-BSA-H的偶聯(lián)比分別為4.31、6.44和6.53，GLP1-BSA-L和GLP3-BSA-L的偶聯(lián)比為4.24和

4、4.99。
　?。?）龍須菜多糖偶聯(lián)蛋白的免疫原性研究：用制備的多糖-BSA偶聯(lián)物免疫實(shí)驗(yàn)小鼠，間接ELISA法測定小鼠抗血清效價(jià)的P/N值，發(fā)現(xiàn)龍須菜多糖各組分與BSA偶聯(lián)物均產(chǎn)生了較高滴度的抗體，抗體效價(jià)都超過4096倍（即212），與各組分純多糖對照組比較，均存在極顯著差異（p<0.01），其中GLP2-BSA-M組的免疫效果最好，抗體效價(jià)較其他取代度組有顯著差異（p<0.05）。從GLP1-BSA-L組、GLP2-BSA-

5、L組、GLP3-BSA-L組的P/N值可知，不同分子量的多糖組分的偶聯(lián)產(chǎn)物，其抗體效價(jià)差異不顯著。結(jié)果表明多糖與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后免疫原性增強(qiáng)，多糖分子量對多糖蛋白偶聯(lián)物的免疫作用無影響。
　?。?）龍須菜多糖抗體ELISA檢測方法的建立：通過優(yōu)化間接ELISA法的檢測條件，得到最優(yōu)的檢測程序條件如下：龍須菜多糖抗原最佳包被濃度25μg/mL；血清最佳稀釋倍數(shù)為1:1280；最佳封閉液為1%明膠溶液，封閉時(shí)間1 h；酶標(biāo)二抗最佳工作濃度

6、為1：1000，作用時(shí)間1 h；待測血清最佳作用時(shí)間為1 h；底物顯色時(shí)間10 min。根據(jù)以上優(yōu)化條件進(jìn)行間接ELISA檢測，450 nm處測得的OD值最接近于1.0且大于1.0，對應(yīng)的P/N值也較大。
　?。?）龍須菜多糖對Hela細(xì)胞免疫抑制因子分泌水平的影響：MTT法測得GLP對HeLa細(xì)胞生長的最大無毒性作用濃度為140μg/mL，對正常的人腎上皮293T細(xì)胞無毒副作用。對陰性對照組培養(yǎng)液上清中的免疫抑制因子IL-10和

7、TGF-β1檢測結(jié)果表明，HeLa細(xì)胞能分泌較高水平的IL-10和TGF-β1。與陰性對照組比較，當(dāng)GLP以最大無毒性濃度作用HeLa細(xì)胞后，可下調(diào)IL-10的分泌水平(p<0.05)，但對TGF-β1的分泌幾乎無影響。
　　本研究結(jié)果顯示作為半抗原的龍須菜多糖通過與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)后，經(jīng)小鼠體內(nèi)免疫，顯示出較理想的免疫原性，說明通過偶聯(lián)反應(yīng)獲得多糖-蛋白偶聯(lián)物是提高多糖免疫原性的一種有效途徑，可拓展多糖在免疫方面的應(yīng)用