絲狀支原體山羊亞種膜蛋白的組成與免疫原性研究.pdf

1、山羊傳染性胸膜肺炎(CCPP)，是山羊特有的急性或慢性高度接觸性傳染病。感染該病的山羊常常引起胸腔的病變，臨床上以高熱、咳嗽、呼吸道噦音、卡他性鼻液、眼結(jié)膜炎、纖維素性胸膜炎、肺炎以及部分母羊流產(chǎn)、進(jìn)行性消瘦為主要特點(diǎn)。它被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類傳染病。古典的山羊傳染性胸膜肺炎病原是山羊支原體山羊肺炎亞種(Mccp)，原稱生物型F38。它屬于絲狀支原體簇，該簇共有六個(gè)成員，除了Mccp外，還包括：山羊支原體山羊亞種(Mcc)

2、；絲狀支原體絲狀亞種SC型(MmmSC)；絲狀支原體絲狀亞種LC型(MmmLC)；絲狀支原體山羊亞種(Mmc)；牛支原體第七群(Mbg7)。從目前的報(bào)道來(lái)看，我國(guó)的CCPP病原主要包括：山羊支原體山羊肺炎亞種(Mccp)、絲狀支原體山羊亞種(Mmc)、綿羊肺炎支原體(MO)、絲狀支原體絲狀亞種SC型(MmmSC)等。本試驗(yàn)旨在對(duì)重慶分離到的CCPP病原進(jìn)行分子生物學(xué)方面的鑒定及對(duì)其膜蛋白的組成及免疫原性進(jìn)行初步研究，建立有效的分子生物學(xué)

3、方法，為對(duì)重慶山羊傳染性胸膜肺炎的流行病學(xué)調(diào)查以及進(jìn)一步研制亞單位疫苗或診斷抗原等后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。 首先根據(jù)支原體的高度保守序列16S rRNA及MmmLC和Mmc的脂蛋白LppA序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，對(duì)CCPP的病原重慶分離株進(jìn)行鑒定。采用飽和酚抽提方法制備目的菌株基因組DNA，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果兩對(duì)引物均擴(kuò)增出了目的條帶，而對(duì)照組沒(méi)有擴(kuò)增出條帶。此反應(yīng)體系具有較強(qiáng)的特異性，檢測(cè)下限可達(dá)10ng/mL

4、 DNA。因此初步將山羊傳染性胸膜肺炎病原重慶分離株鑒定為絲狀支原體山羊亞種。 其次是對(duì)絲狀支原體山羊亞種重慶分離株的膜蛋白組成和免疫原性進(jìn)行研究，以明確菌體中具有免疫原性的膜蛋白片段，找出保護(hù)性抗原片段，為防制該病提供理論依據(jù)。采用超聲波將菌體破碎之后再用去垢劑SLs將膜蛋白釋放出來(lái)，進(jìn)而采用梯度超速離心將膜蛋白沉淀下來(lái)。膜蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析以確定膜蛋白的組成，采用考染和銀染兩種方法對(duì)膠塊進(jìn)行染色。結(jié)果表明：PG3的膜

5、蛋白分子量范圍在99.7kDa-15.4 kDa之間，共有11條帶，分子量分別為：99.7kDa，81.9 kDa，75.1 kDa，65.6 kDa，57.4kDa，51.1kDa，27.8kDa，25.2 kDa，20.1 kDa，16.8 kDa，15.4kDa；而三株分離株的膜蛋白條帶基本相同，分子量范圍均在100.6kDa-17.1 kDa之間，共有13條帶，分別為：100.6 kDa，94.5 kDa，81.3 kDa，75

6、.4 kDa，72.7 kDa，65.1 kDa，62.4 kDa，51.3 kDa，48.0 kDa，33.2 kDa，25.1 kDa，20.1 kDa，17.1 kDa。分離株之間的膜蛋白成份沒(méi)有明顯差異，而分離株與標(biāo)準(zhǔn)株的膜蛋白組成基本相同，兩者有四條相同的條帶：81.9 kDa，75.1 kDa，65.6 kDa和51.1kDa。所提取的膜蛋白還用于免疫印跡和淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。將膜蛋白定量與佐劑充分乳化后免疫家兔，制備抗血清。

7、當(dāng)瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)到1：16時(shí)即采血分離血清，采用飽和硫酸銨法純化IgG，用于免疫印跡反應(yīng)。同時(shí)，在免疫后隔周采血分離血清，采用間接ELISA測(cè)定免疫后7周內(nèi)的抗體效價(jià)，并繪制抗體消長(zhǎng)曲線圖。結(jié)果表明，各個(gè)菌株均在免疫一周后產(chǎn)生了特異性抗體，效價(jià)為1：400.1：800：而在三免后效價(jià)均達(dá)到了最高點(diǎn)，為1:6400-1:12800，此后效價(jià)開(kāi)始下降，在兩周內(nèi)效價(jià)維持在1:3200-1:6400水平，而在免疫后第六周效價(jià)下降得更快。說(shuō)明抗體效價(jià)

8、與免疫時(shí)間、免疫次數(shù)呈正相關(guān)。首免后隔周外周采血，肝素鈉抗凝并加入等量淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。采用MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(LTR)。試驗(yàn)組加入適量膜蛋白使其終濃度為500βg/mL，對(duì)照組加入等量的DMEM完全培養(yǎng)基：于培養(yǎng)結(jié)束前4h加入MTF，培養(yǎng)結(jié)束后，加入50％DMF-20％SDS裂解液，稍加振蕩后避光放置1h；測(cè)定OD560并根據(jù)公式計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明：PG3及分離株膜蛋白均能明顯刺激淋巴細(xì)胞體外增殖，表明試驗(yàn)

9、家兔對(duì)該膜蛋白具有特異性免疫反應(yīng)，從而提示了膜蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。 用純化的IgG和所提取的膜蛋白進(jìn)行免疫印跡。首先將純化后的膜蛋白抗原與陰性血清進(jìn)行免疫印跡，消除非特異性反應(yīng)。每一菌株均首先與其自身膜蛋白抗血清反應(yīng)，以尋找出能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的膜蛋白片段。然后將標(biāo)準(zhǔn)株與分離株的膜蛋白抗原、抗血清進(jìn)行交叉反應(yīng)，以證明標(biāo)準(zhǔn)株與分離株之間是否存在共同的具有免疫原性的蛋白質(zhì)片段。結(jié)果表明：PG3株與其自身膜蛋白抗血清反應(yīng)時(shí)，出現(xiàn)了

10、四條顏色較深的條帶，分子量大小分別為：94.5kDa，65.6 kDa，62.5 kDa，.53.0 kDa。而當(dāng)抗PG3血清與分離株抗原反應(yīng)時(shí)，在65.6 kDa和53.0 kDa處存在交叉反應(yīng)。分離株膜蛋白抗原與自身膜蛋白抗血清反應(yīng)時(shí)，同樣出現(xiàn)了四條顏色較深的條帶，分別是：101.4 kDa，84.9 kDa，62.5 kDa，53.0 kDa。而當(dāng)PG3膜蛋白抗原分別與抗各分離株膜蛋白血清交叉反應(yīng)時(shí)，同樣出現(xiàn)了兩條顏色較深的條帶，