龍須菜多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、生物活性及作用機(jī)制研究.pdf

1、龍須菜(Gracilaria lemaneiformis Weber-van Boss)是江蘺屬（Gracilaria）的一種溫帶性紅藻，屬紅藻門(Rhodophta)、真紅藻綱(Florideophyceae)、杉藻目(Gigartinales)、江籬科(Gracilariales)。龍須菜分布于中國(guó)、日本等國(guó)，在我國(guó)原產(chǎn)于山東省沿海，近年來(lái)在廣東、福建等省實(shí)現(xiàn)規(guī)?；B(yǎng)殖，產(chǎn)量逐年增加。其主要用途是作為瓊膠生產(chǎn)的原料，鮑魚飼料及綠色食

2、品開發(fā)，也可作為金屬富集器。龍須菜的研究才剛剛起步，目前國(guó)外未見有關(guān)龍須菜生物活性方面的研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)也只有少數(shù)學(xué)者對(duì)龍須菜多糖的生物活性進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗突變、抗腫瘤、清除自由基和抗氧化作用，但有關(guān)龍須菜多糖提高免疫力和多糖純化方面的報(bào)道甚少。本文對(duì)龍須菜粗多糖進(jìn)行了分離純化和化學(xué)結(jié)構(gòu)研究，并重點(diǎn)研究了龍須菜多糖的免疫調(diào)節(jié)活性，同時(shí)探討了體外抗氧化以及體外抗腫瘤活性，以期為龍須菜活性多糖的開發(fā)提供更廣泛的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3、r>　　1、龍須菜多糖的提取、分離及理化性質(zhì)研究
　　龍須菜多糖提取工藝研究表明，室溫提取比高溫提取多糖具有更好的刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用，且提取率更高，因此本文選擇室溫作為龍須菜多糖提取溫度，經(jīng)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得室溫下龍須菜多糖提取最佳工藝，即料液比1∶20，提取時(shí)間12h，提取次數(shù)3次，多糖得率為9.96％。
　　通過(guò)比較一步脫硫酸基法和兩步脫硫酸基法對(duì)龍須菜粗多糖硫酸基脫除效果發(fā)現(xiàn)，采用兩步脫除方法可以得到較

4、理想的硫酸基脫除效果和較好的多糖回收率，硫酸基脫除率最高達(dá)72.9％，多糖回收率達(dá)48.9％。
　　采用超濾分級(jí)、DEAE-陰離子交換柱層析和凝膠柱層析等純化方法對(duì)龍須菜多糖進(jìn)行了系統(tǒng)的分離純化。龍須菜室溫提取粗多糖GCp經(jīng)超濾分級(jí)獲得GCpF1（1-10萬(wàn)）和GCpF2（＞10萬(wàn)），經(jīng)DEAE-陰離子交換柱層析GCpF1被分為5個(gè)組份（GCpF1-1、GCpF1-2、GCpF1-3、GCpF1-4和GCpF1-5），GCpF2被

5、分為4個(gè)組份(GCpF2-1、GCpF2-2、GCpF2-3和GCpF2-4)，進(jìn)一步凝膠層析獲得三種均一多糖，GCpF1-1B、GCpF2-1B和GCpF2-3B。紫外掃描顯示GCpF2-1B和GCpF2-3B在280nm和260nm處沒有吸收峰，表明兩種均一多糖不含蛋白質(zhì)和核酸，或含量極低。經(jīng)HPLC測(cè)定GCpF1-1B、GCpF2-1B和GCpF2-3B的分子量分別為9.3×104 Da、1.10×105Da和1.03×105 D

6、a。
　　2、多糖結(jié)構(gòu)的研究
　　通過(guò)單糖組成分析、紅外光譜和核磁共振（一維:1H NMR譜、13C NMR譜;二維:1H-1H COSY譜、TOCSY譜、NOESY譜、HMQC譜和HMBC譜）方法，對(duì)GCpF2-1B和GCpF2-3B的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。
　　紅外光譜顯示，GCpF2-1B具有典型的吡喃糖環(huán)特征和硫酸基特征吸收峰。進(jìn)一步分析顯示GCpF2-1B一級(jí)結(jié)構(gòu)主要由[→3）-β-D-吡喃半乳糖(G)-(1→4)

7、-α-L-3，6-內(nèi)醚吡喃半乳糖(A)-（1→]重復(fù)單元和[→3）-β-D-吡喃半乳糖（G*）-(1→4)-6-硫酸-α-L-吡喃半乳糖（A*）-（1→]組成，其中A*∶A=1∶1.5。
　　多糖GCpF2-3B與GCpF2-1B一級(jí)結(jié)構(gòu)相似，也主要由[→3）-β-D-吡喃半乳糖(G)-(1→4)-α-L-3，6-內(nèi)醚吡喃半乳糖(A)-（1→]重復(fù)單元和[→3）-β-D-吡喃半乳糖（G*）-(1→4)-6-硫酸-α-L-吡喃半乳糖

8、（A*）-（1→]組成，但A*∶A=1∶2.0。
　　3、多糖生物活性研究
　　室溫下浸提多糖GCp刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖的作用優(yōu)于采用傳統(tǒng)熱水浸煮工藝和高溫高壓(121℃)提取工藝獲得的多糖，且后兩者刺激作用相當(dāng)。GCp經(jīng)超濾分級(jí)獲得組份GCpF1和GCpF2的刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性高于Sevag法脫蛋白處理后所得樣品GCp-S和凍融處理后所得樣品GCp-1和GCp-2，也高于GCp，表明超濾分級(jí)適合龍須菜粗品的初步分離

9、，活性成分得到有效保留。GCpF1和GCpF2經(jīng)DEAE離子柱層析后所得組份均保持了較好的刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用，其中水相洗脫組份GCpF1-1和GCpF2-1活性明顯高于其他洗脫組份，同時(shí)也略優(yōu)于GCpF1和GCpF2，而其他組份活性均低于GCpF1和GCpF2。均一多糖GCpF1-1B和GCpF2-1B具有良好的刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用，呈現(xiàn)劑量依賴性，其中GCpF1-1B活性更好，而均一多糖GCpF2-3B雖然也表現(xiàn)出一定的刺

10、激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用，但活性顯著低于前兩種均一多糖;3種均一多糖與相應(yīng)的DEAE陰離子柱組份相比活性均有一定提高。
　　龍須菜多糖在體外沒有表現(xiàn)出抑制L1210腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
　　抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，GCp、GCpF1和GCpF2對(duì)游離的超氧陰離子自由基、羥自由基和H2O2均有一定的清除作用，尤其是低濃度時(shí)，清除率與多糖濃度呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，但當(dāng)濃度升高到一定程度繼續(xù)增加濃度，清除率不再升高。均一多糖GCpF2-1B

11、和GCpF2-3B對(duì)三種自由基的清除作用有所提高;并且樣品GCpF2-1B對(duì)三種活性氧的IC50均顯著低于GCpF2-3B，表明GCpF2-1B活性高于GCpF2-3B。
　　4、龍須菜均一多糖GCpF2-1B免疫調(diào)節(jié)作用研究
　　GCpF2-1B處理小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7后，細(xì)胞體積彭大，并有偽足形成，表明其呈明顯活化狀態(tài);GCpF2-1B可刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO，還可刺激RAW264.7細(xì)胞增加1L-1