發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸

1、發(fā)酵法生產(chǎn)發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸透明質(zhì)酸透明質(zhì)酸(HyaluronicacidHA)是一種大分子的粘多糖是一種由DN乙酰氨基葡萄糖和βD葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元β1，4糖苷鍵連接成的一種鏈狀高分子粘多糖。其分子量在幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)之間，又稱糖醛酸，透明質(zhì)酸具有特殊的保水作用，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保濕性最好的物質(zhì)，被稱為理想的天然保濕因子，為目前所公認(rèn)的最佳保濕成分，在化妝品工業(yè)、醫(yī)學(xué)研究、臨床治療等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。透明質(zhì)酸的提煉的方法有三種：組

2、織提取，微生物發(fā)酵和化學(xué)合成。組織提取法和化學(xué)合成法的成本高，產(chǎn)量低，受原料資源限制，不能滿足市場(chǎng)需求。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸具有不受原料資源限制、成本低、產(chǎn)量高、有較高的相對(duì)分子量、分離純化工藝簡(jiǎn)便、易于大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)成為透明質(zhì)酸生產(chǎn)的發(fā)展方向，因此開(kāi)發(fā)先進(jìn)的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA的技術(shù)十分必要。目前HA產(chǎn)業(yè)前景廣闊，發(fā)酵法己成為HA生產(chǎn)的主流工藝，而發(fā)酵法生產(chǎn)HA的工藝仍需進(jìn)一步完善。微生物產(chǎn)HA的研究可以追溯到上個(gè)世紀(jì)30年代

3、，1937年，Kendall發(fā)現(xiàn)鏈球菌可以產(chǎn)生HA，后來(lái)發(fā)現(xiàn)主要是一些A群和C群鏈球菌，它們具有合成與代謝以HA為主要成分的莢膜的能力。隨后很多人進(jìn)行了大量的研究。研究結(jié)果證明某些種屬鏈球菌在一定的環(huán)境條件下，能同化吸收葡萄糖或其他碳源，以代謝物形式產(chǎn)生HA。隨后經(jīng)過(guò)不斷地選育菌種和優(yōu)化工藝，借助現(xiàn)代深層發(fā)酵技術(shù)與設(shè)備，HA的微生物發(fā)酵法被建立和應(yīng)用起來(lái)。目前多選用鏈球菌、乳酸球菌類等（因此以下均以鏈球菌舉例說(shuō)明）。日本用發(fā)酵法生產(chǎn)了H

4、A制劑并對(duì)該產(chǎn)品做了大量的藥效、毒理、藥代動(dòng)力學(xué)等非臨床實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，發(fā)酵法生產(chǎn)的HA無(wú)局部及全身毒副作用、安全性高、療效確切。發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸主要包括兩部分：發(fā)酵部分和下游提取工藝部分。發(fā)酵法生產(chǎn)HA的質(zhì)量主要取決于菌種、培養(yǎng)基和分離提純工藝的選擇。一.發(fā)酵部分：發(fā)酵部分：經(jīng)過(guò)閱讀與分析文獻(xiàn)，我個(gè)人將發(fā)酵部分劃分為以下幾個(gè)模塊：1.菌種的篩選2.菌種的誘變3.培養(yǎng)基配方的優(yōu)化4.菌株的最佳培養(yǎng)條件首先以鏈球菌制備HA的過(guò)

5、程為例簡(jiǎn)單介紹一下發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的基本流程：鏈球菌復(fù)蘇培養(yǎng)后，用誘變劑誘變，挑出不溶血、不含HA酶的高產(chǎn)率菌株。進(jìn)行穩(wěn)定傳代后增菌培養(yǎng)，所得的菌種即可作為生產(chǎn)菌株。放入發(fā)酵培養(yǎng)液后，在通風(fēng)攪拌的情況下發(fā)酵40小時(shí)，對(duì)粘稠的發(fā)酵醪進(jìn)行提純分離等處理后得到分子量高、粘度大的HA。品做對(duì)照。(6)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定：采用粘度法。使用0506mm的烏式粘度計(jì)，參比液為02mol／L氯化鈉，測(cè)定溫度30℃，三點(diǎn)外推出特性粘數(shù)[]，根據(jù)公式[]=

6、3.6x104Mr的0.78次方，計(jì)算出產(chǎn)品的平均相對(duì)分子質(zhì)量Mr。2.2.菌種的誘變：菌種的誘變：以鏈球菌為例，野生型的鏈球菌多會(huì)產(chǎn)生溶血素(Streptolysin)，溶血素混入成品HA，會(huì)使HA的品質(zhì)降低。一般情況下不會(huì)超過(guò)2gL，得到的HA分子量也很低所以規(guī)模生產(chǎn)必須獲得非溶血性的菌株。因此必須經(jīng)過(guò)誘變等手段獲得HA產(chǎn)量高、優(yōu)良性狀穩(wěn)定的菌株。誘變菌種的常規(guī)方法是以紫外線和γ射線為誘變劑的物理誘變方法和化學(xué)試劑如亞硝基胍、硫酸二

7、乙酯等。但化學(xué)誘變劑污染環(huán)境、操作不安全，有待改進(jìn)。誘變工作中，應(yīng)該盡量利用菌落可以鑒別的特性進(jìn)行初篩，把初篩選得菌株用搖瓶方法測(cè)定，可提高工作效率。21菌種誘變步驟菌種平面培養(yǎng)同步培養(yǎng)制備菌液誘變處理中間培養(yǎng)稀釋涂平板突變株分離保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)22菌種誘變操作方法221平面培養(yǎng)將篩選的菌種挑取一環(huán)接種到平板培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)14—16h。222同步培養(yǎng)從平面培養(yǎng)基上菌落上挑取23環(huán)接種到盛有20ml培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，37℃

8、振蕩培養(yǎng)14—16h。223制備菌液將菌液進(jìn)行離心3500r／min，離心10min后棄上清。供紫外線誘變處理的菌體用生理鹽水洗滌2次，重新懸浮于5ml生理鹽水中，搖勻后倒人盛有45mi滅菌生理鹽水并帶玻璃珠的100ml錐形瓶中，振蕩10min，調(diào)整細(xì)胞濃度至10／ml。供NTG誘變處理的菌體用01molL，pH=60磷酸鹽緩沖液來(lái)代替生理鹽水，其它同供紫外線誘變處理菌體的菌液制備。224誘變處理2.2.4.1紫外線誘變處理：紫外線誘變

9、的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體，二聚體的出現(xiàn)會(huì)減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)的扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對(duì)，從而有可能引起菌株的突變或死亡。(l)預(yù)熱紫外線：紫外燈功率15W，照射距離30cm，照射前打開(kāi)紫外燈預(yù)熱20min，使紫外線強(qiáng)度穩(wěn)定。(2)加菌液：兩套標(biāo)明1min和2min的無(wú)菌培養(yǎng)皿，分別加入3ml菌液和磁力攪拌棒。(3)照射：將上述兩套培養(yǎng)皿磁力攪拌器上，打開(kāi)皿蓋攪拌照射1min和