大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞復合膠原-透明質(zhì)酸支架成軟骨分化的實驗研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨損傷后有限的自身修復能力及其對人體功能的嚴重影響，使其成為骨科基礎(chǔ)和臨床研究中的熱點和難點課題，目前尚未得到很好的解決。傳統(tǒng)的治療如微骨折、磨削成形術(shù)、骨膜軟骨膜移植、骨軟骨移植、人工關(guān)節(jié)置換等均存在一定的不足。近年來組織工程的發(fā)展有望成為治療軟骨損傷的新方法。組織工程是應用細胞生物學和工程學的原理，對病損組織結(jié)構(gòu)和功能的修復與重建進行研究開發(fā)的一門新興學科。與胚胎干細胞、基因工程一起被認為是生命科學發(fā)展史上的又一個里程碑，標志

2、著人類將走出單純器官移植領(lǐng)域，步入組織、器官再造的新領(lǐng)域。但目前組織工程軟骨應用急需解決的問題有：①具有較強增殖能力和多分化潛能的細胞；②合適的細胞載體；基于以上要求，本實驗進行了以下三部分實驗的研究。 第一章大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)及生物學特性的實驗研究 目的:掌握大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和擴增的方法，并探討其部分生物學特性。 方法:無菌技術(shù)下切取大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪墊，加入適量I型膠原酶消

3、化獲取細胞，接種入含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細胞形態(tài)變化。取傳代細胞用流式細胞儀和免疫細胞化學檢測表面抗原標志CD29、CD34、CD44。MTT法測定第2、5、10代細胞的生長曲線。并測定細胞的貼壁率。 結(jié)論:從大鼠脂肪中分離的細胞具有間充質(zhì)干細胞的特性，能長期培養(yǎng)，生長穩(wěn)定、增殖較快，可以作為組織工程的種子細胞。 第二章大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞成軟骨誘導分化的實驗研究 目的:探討AD

4、MSCs向成軟骨方向分化的條件，為進一步實驗打下基礎(chǔ)。 方法:按照第一章實驗方法分離培養(yǎng)細胞。取第5代細胞，分別以1×10<'7>／mL和5×10<'6>／mL的細胞密度行“micromaSS”法接種，加入誘導培養(yǎng)基定向誘導培養(yǎng)，即1％新生牛血清+1ng／mL的TGF-βl+6.25μg／mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+6.25μg／mL胰島素。部分培養(yǎng)孔中加入0.1nmol／mL地塞米松，于誘導培養(yǎng)2w時進行阿爾新蘭和甲苯胺藍染色以及Ⅱ型膠原免

5、疫細胞化學染色。于誘導培養(yǎng)7d、14d用RT-PCR鑒定II型膠原mRNA表達。 結(jié)論:大鼠ADMSCs在新生牛血清、TGF-βl、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素的作用下可以向成軟骨細胞分化，而且以1×10<'7>／mL的細胞密度誘導培養(yǎng)成軟骨能力要高于5×10<'6>／mL。地塞米松可以加速其成軟骨分化。 第三章大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞復合膠原／透明質(zhì)酸支架成軟骨分化的實驗研究 目的:探討大鼠脂肪ADMSCs在膠原／透明質(zhì)酸三維

6、支架上培養(yǎng)、定向誘導分化成軟骨的能力。 方法:按照第一章實驗方法分離培養(yǎng)細胞。取第5代細胞，以1×10<'7>／mL的細胞密度接種于膠原海綿／透明質(zhì)酸支架上，加入誘導培養(yǎng)基定向誘導培養(yǎng)，即1％新生牛血清+1ng／mL的TGF-β1+6.25μg／mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+6.25μg／mL胰島素+O.1nmol／mL地塞米松。于培養(yǎng)3周時將支架制備成石蠟切片分別進行HE染色、阿爾新蘭染色、加苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色。同時進行RT