家蠶不同發(fā)育階段抗壞血酸含量變化及其合成關(guān)鍵酶同源基因的研究.pdf

1、抗壞血酸又稱(chēng)為維生素C（VC），在生物體內(nèi)具有重要的生理功能。從低等的單細(xì)胞生物到高等的動(dòng)植物，很多生物均能從頭合成還原型抗壞血酸（AsA）。但目前對(duì)于昆蟲(chóng)自身能否合成AsA尚不明確。雖然AsA對(duì)于家蠶幼蟲(chóng)是必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但在卵期和蛹期等不取食階段，體內(nèi) AsA的含量在特定發(fā)育時(shí)期都保持相對(duì)穩(wěn)定。目前還沒(méi)有研究確定家蠶體內(nèi)的AsA僅來(lái)源于食物而自身不能合成。為此，本文測(cè)定了家蠶在不同發(fā)育階段體內(nèi)抗壞血酸含量的變化，探討了 AsA合成代

2、謝關(guān)鍵酶的同源基因及其表達(dá)變化。
　　首先，本試驗(yàn)用分光光度法測(cè)定了家蠶在不同發(fā)育時(shí)期以及不同條件下總抗壞血酸（TAA）和AsA含量的變化。結(jié)果表明，對(duì)于取食階段的家蠶幼蟲(chóng)采用缺乏VC的人工飼料飼養(yǎng)，雖然與正常飼料飼養(yǎng)的家蠶相比生長(zhǎng)發(fā)育相對(duì)緩慢，但仍能發(fā)育到4齡。滯育卵中TAA含量在產(chǎn)卵72 h內(nèi)、AsA含量在產(chǎn)卵24 h內(nèi)均有所增加，此后二者的含量有不同程度降低，并一直保持相對(duì)穩(wěn)定。正常胚胎發(fā)育的蠶卵，產(chǎn)卵24 h內(nèi)AsA含量顯

3、著增加，產(chǎn)卵48 h~144 h，AsA含量一直保持較高水平，直到胚胎發(fā)育后期才明顯下降，而且非滯育卵的AsA含量一直高于滯育卵。幼蟲(chóng)期取食桑葉或添加VC的人工飼料之后，TAA含量和AsA的含量增加，眠中、取食缺乏VC的人工飼料及饑餓一定時(shí)間后，蠶體中的TAA和AsA的含量均明顯降低，尤其是饑餓幼蟲(chóng)的AsA含量下降到很低的水平。蛹期TAA含量無(wú)顯著變化，但雌蛹體內(nèi)AsA含量在化蛹0~24 h顯著升高，雄蛹體內(nèi)AsA含量總體上在0~144

4、 h變化不顯著，一直保持較高的含量，直到蛹的后期A(yíng)sA含量才有較為明顯的下降。
　　其次，利用已知生物的AsA合成酶基因的氨基酸序列在家蠶數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)檢索AsA合成酶的同源基因、利用MEGA等生物信息學(xué)軟件對(duì)基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和分析，獲得AsA合成代謝最后一步的關(guān)鍵酶古洛糖酸內(nèi)脂氧化酶（GULO）及倒數(shù)第二步的關(guān)鍵酶醛糖內(nèi)脂酶（ALase）的同源基因分別為：BmGULO_like1、BmGULO_like2和BmALase_

5、like1、BmALase_like2。由于從低等單細(xì)胞生物到高等的靈長(zhǎng)類(lèi)，幾乎均含有完整或部分AsA合成酶基因，并且AsA具有的廣泛的生理功能，推測(cè)家蠶中應(yīng)該也存在此基因。
　　最后，利用Primer軟件設(shè)計(jì)家蠶的4個(gè)AsA合成酶同源基因的引物，采用熒光定量PCR檢測(cè)了AsA合成相關(guān)酶同源基因在家蠶不同發(fā)育階段的表達(dá)變化。結(jié)果表明，BmGULO_like1、BmGULO_like2、BmALase_like1和BmALase_l

6、ike2等4個(gè)基因在卵期及蛹期的中腸和脂肪體中的表達(dá)量總體上都顯著高于幼蟲(chóng)期的中腸和脂肪體，并且這4個(gè)基因的表達(dá)量在卵期和蛹期都隨著發(fā)育進(jìn)展呈上升趨勢(shì)。
　　本試驗(yàn)結(jié)果提示，在胚胎發(fā)育過(guò)程中及蛹期存在 AsA的來(lái)源途徑，可能包括AsA自身合成途徑及由氧化型抗壞血酸（DHA）還原為 AsA途徑，而在幼蟲(chóng)期主要從食物中吸收VC，缺乏其他來(lái)源。根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)，雖然家蠶中GULO的同源基因與其他已知生物的相似度較低，但家蠶仍有可能具有合