基因芯片技術篩選不同發(fā)育階段人表皮干細胞差異表達基因的研究.pdf

1、目的：利用基因芯片技術篩選不同發(fā)育階段人表皮干細胞差異表達基因，分析不同發(fā)育階段人表皮干細胞基因表達變化的特征及其可能的生物學意義，為進一步探討表皮干細胞增殖分化調控機制提供新思路和線索。 方法：收集28～32周胎兒，4～12周歲少兒、35～55歲成年人3組正常人皮膚標本，采用胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮，Ⅳ型膠原快速粘附法分離、純化人表皮干細胞，免疫細胞化學染色法分別行β1整合素、K19單抗檢測鑒定。將21522條Ol

2、igo DNA用點樣儀點制在一張經過化學修飾的載玻片上制備成表達譜芯片。按Trizol一步法分別提取各組細胞總RNA，瓊脂糖甲醛變性膠電泳質檢。通過逆轉錄方法將Cy3熒光標記到Human對照組DNA上（以人類基因作為共同參照），將Cy5熒光標記到實驗組（胎兒組、少兒組與成人組）cDNA上，制成探針，并與表達譜芯片進行雜交及掃描芯片熒光信號圖像。采用LuxScan3.0圖像分析軟件對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數字信號，以2倍差異表

3、達值（Ratio）篩選差異表達基因。選擇明顯上調或抑制的基因，用Real time RT-PCR技術對相關的基因作進一步驗證。 結果：基因芯片高通量地揭示了胎兒、少兒和成人組表皮干細胞的遺傳信息。成人組與少兒組樣本相比，差異表達基因有1808條，其中上調的基因有1089條，下調的基因有719條；已知基因1462條（已在Gene Bank登錄），未知基因346條。少兒與胎兒組樣本相比，差異表達基因有4534條，其中上調的基因有17

4、83條，下調的基因有2751條；已知基因3577條（已在Gene Bank登錄），未知基因957條。對篩選出的成人與少兒，少兒與胎兒的差異表達基因結果在Molecu-le Annotation System進行了Go分類的統(tǒng)計分析，根據基因功能分類，成人與少兒差異表達基因可分為128類，少兒與胎兒差異表達基因可分為216類，因一個基因可以有多個功能，其總數大于篩選出的差異基因總和。其中1104條基因在胎兒、少兒與成人組樣本中呈持續(xù)差異表

5、達，根據基因功能分為32類。差異基因涉及蛋白質翻譯、能量合成和DNA復制，均與表皮干細胞的發(fā)育進程密切相關。實驗檢測到持續(xù)差異表達基因中有94條基因表達差異呈持續(xù)上調，75條表達差異呈持續(xù)下調。表達持續(xù)上調的基因類別主要為核苷酸結合蛋白基因（如NM_005381、NM_024045）、蛋白質折疊結合相關基因（如NM_002157、NM_006260）、鋅離子結合蛋白基因和ATP結合蛋白基因等。表達持續(xù)下調的基因類別主要為GTP結合蛋白基

6、因、序列特異性DNA結合蛋白基因（如NM_005253、NM_001421）、促分裂原活化蛋白激酶基因（如NM_002746、NM_002754）、核仁蛋白家族基因和細胞外基質結構蛋白基因等。Real time RT-PCR結果顯示胎兒、少兒與成人樣本中TUBGCP3表達量持續(xù)增高，而FOSL2的表達量持續(xù)降低，與芯片篩選結果相一致，說明本次基因芯片篩查結果真實、可靠。 結論：體外培養(yǎng)的胎兒、少兒與成人表皮干細胞基因表達譜有明顯