柔嫩艾美耳球蟲菱形蛋白樣蛋白酶(EtROMs)基因的克隆不及不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平研究.pdf

1、菱形蛋白樣蛋白酶(Raomboid-like Proteases,ROMs)是一類在真核和大多數(shù)原核生物中高度保守的跨膜絲氨酸蛋白酶。該酶為罕見的多起源酶,能夠在接近胞膜跨膜區(qū)或膜內(nèi)將蛋白水解為多肽釋放,而催化活性的發(fā)揮依賴于鑲嵌在膜表面以下的親水催化中心。研究結(jié)果表明ROMs功能涉及不同物種的多個方面,如細(xì)胞內(nèi)生長因子的信號傳遞過程、細(xì)菌的群體敏感性產(chǎn)生、真核生物線粒體膜的融合、正常細(xì)胞的凋亡、頂復(fù)門原蟲宿主入侵及真核生物干細(xì)胞分化等

2、。目前,ROMs在頂復(fù)門原蟲中的大部分功能還沒有鑒定出來,但是ROMs在蟲體入侵宿主過程中加工、成熟微線蛋白、頂膜抗原等細(xì)胞表面粘附分子。輔助蟲體入侵直至納蟲空泡膜形成的作用已被證實。
　　 本研究利用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)技術(shù)注釋拼接獲得柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)的三種ROMs基因序列,包括EtROM1、EtROM全長ORF序列和EtROM4部分序列。根據(jù)預(yù)測序列設(shè)計特異性引物,以E.tenella(廣

3、東株)子孢子總RNA為模板。用RT-PCR的方法成功擴(kuò)增出EtRoM1、EtROM3和EtROM4的ORF序列。測序結(jié)果表明EtROM1 ORF序列全長864 bp,編碼287 aa:EtROM3 ORF序列全長774 bp,編碼257 aa； EtROM4全長ORF序列為1677 bp,編碼558 aa。然后對擴(kuò)增得到的EtROM1、EtROM3和EtROM4進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明三者均存在完整的Raomboid Superfa

4、mily保守結(jié)構(gòu)域和作為ROMs蛋白酶家族成員特異性的7個跨膜區(qū)結(jié)構(gòu).與其它頂復(fù)門原蟲ROMs蛋白質(zhì)序列的相似性在21％-60％之間。
　　 利用實時熒光定量PCR(real-time PCR)方法對EtROM1,EtROM3和EtROM4基因在柔嫩艾美爾球蟲不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測。提取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子四個時期的總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA后做模板,以Etact

5、in為參照基因,對EtROM1、EtROM3和EtROM4三個基因進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示三個基因均在子孢子階段轉(zhuǎn)錄水平最高,未孢子化卵囊階段最低,表明他們均在子孢子階段大量分泌,提示其功能與子孢子宿主細(xì)胞入侵過程有關(guān)。其中,EtROM1和EtROM4兩個基因的轉(zhuǎn)錄水平總體趨勢一致,子孢子階段達(dá)到頂峰且分別為裂殖子時期的20.11和20.58倍,未孢子化卵囊階段最低,孢子化卵囊與裂殖子期大致相同,說明了它們主要在子孢