HLAⅡβ基因克隆及HLA DR四聚體的應(yīng)用.pdf

1、研究背景和目的： 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的嚴(yán)重威脅人類健康的以呼吸道系統(tǒng)為主的慢性傳染病。目前，全世界有三分之一的人感染了MTB，其中5％～10％的感染者發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核病，每年死亡人數(shù)高達(dá)200～300萬(wàn)。近年來(lái)，由于人口流動(dòng)、耐藥結(jié)核菌的產(chǎn)生與發(fā)展、結(jié)核菌與人體免疫缺陷病毒(HIV)的雙重感染以及許多國(guó)家結(jié)核病控制措施的不完善，使得結(jié)核病疫情呈明顯上升

2、趨勢(shì)，因此，結(jié)核病已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)的結(jié)核病感染率和發(fā)病率僅次于印度，是全球高負(fù)擔(dān)防治結(jié)核病的國(guó)家之一，防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。結(jié)核病是否發(fā)病不僅與侵入機(jī)體的細(xì)菌數(shù)量和毒力等因素有關(guān)，還與機(jī)體的免疫功能有關(guān)。MTB屬胞內(nèi)感染菌，機(jī)體的抗結(jié)核免疫主要依靠T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫，特別是以CD4+Th1T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。MTB感染后，T淋巴細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)特異性地結(jié)合單核—巨噬細(xì)胞遞呈的

3、抗原，識(shí)別過(guò)程受主要組織相容性復(fù)合物(major histocompability complex，MHC)的限制，廣泛存在組織細(xì)胞中的MHC編碼的分子能經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞(antigen—presenting cell，APC)加工處理后的抗原肽結(jié)合成為激活相應(yīng)毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的始動(dòng)信號(hào)，其中MHC ClassⅡ分子遞呈的抗原肽由CD4+T細(xì)胞特異性的識(shí)別，MHC Class Ⅰ分子遞

4、呈的抗原肽由CD8+T細(xì)胞特異性的識(shí)別，識(shí)別后被激活而增生分化，細(xì)胞因子釋放，單核—巨噬細(xì)胞激活，進(jìn)而殺菌介導(dǎo)一系列的免疫反應(yīng)。 通常T細(xì)胞的識(shí)別是通過(guò)TCR與抗原遞呈細(xì)胞表面的MHC—肽復(fù)合物的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因此，TCR與MHC—肽的特異性相互作用，可以用來(lái)檢測(cè)抗原特異性的T細(xì)胞。但是MHC—肽單體雖然能與TCR結(jié)合，但親和力低，解離速度很快，而不能直接用來(lái)檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Altman等于1996年創(chuàng)建

5、了可溶性MHC/肽四聚體技術(shù)，將復(fù)合物單體四聚化，從而大大提高了MHC/肽復(fù)合物與TCR的親和力和穩(wěn)定性，使這一難題得到解決。 目前，MHC Class Ⅰ/肽四聚體已被廣泛用于分析CD8+T細(xì)胞在抗病毒、抗腫瘤和自身免疫病中的作用。利用基因工程技術(shù)在MHC Ⅰ類分子α鏈的C端加上一段生物素標(biāo)記的序列，構(gòu)建MHC重組分子；通過(guò)大腸桿菌表達(dá)重組蛋白分子的融合蛋白，將其與β2m和抗原肽進(jìn)行體外折疊，形成MHC—肽復(fù)合物；在BirA酶

6、作用下，MHC—肽復(fù)合物被生物素標(biāo)記；生物素標(biāo)記的MHC—肽復(fù)合物與熒光素標(biāo)記的親和素以8：1比例混合，即獲得熒光標(biāo)記的四聚體。相比Ⅰ類分子，MHC Ⅱ類分子是由α鏈和β鏈以非共價(jià)鍵形成的異二聚體，兩條鏈都具有多態(tài)性，體外折疊時(shí)往往不能很好的錨合短肽，其四聚體的制備要復(fù)雜得多。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于MHCⅡ類分子，多采用α、β鏈與BirA酶基因共轉(zhuǎn)染的方法，制備MHcⅡ/肽四聚體。 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)行細(xì)胞免疫檢測(cè)方法多采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(en

7、zyme linked immunospot assay，ELISPO T)和流式細(xì)胞分析術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)等。流式細(xì)胞分析術(shù)(FCM)是借助流式細(xì)胞儀(flow cytometer)對(duì)免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞進(jìn)行快速鑒定和分類的技術(shù)，可對(duì)細(xì)胞的大小、核型、表面分子種類等進(jìn)行定量檢測(cè)和綜合分析，其原理是樣品經(jīng)過(guò)多種熒光素標(biāo)記的抗體染色，因熒光素吸收與發(fā)射光譜的波長(zhǎng)不同，信號(hào)能同時(shí)被接收，從而分析細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況，

8、檢測(cè)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK淋巴細(xì)胞數(shù)等及其比值?，F(xiàn)有FCM在對(duì)結(jié)核病的研究，多集中在CD4+T淋巴細(xì)胞的構(gòu)成比分析上。此外，還可以對(duì)四聚體進(jìn)行組織切片的原位染色研究，利用共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)(confocal laserscanning microscopy CLSM)可以觀察到組織切片中抗原特異的T細(xì)胞以及所處微環(huán)境的空間關(guān)系。尤其是在臨床標(biāo)本的研究中，如組織活檢，當(dāng)浸潤(rùn)的T細(xì)胞數(shù)量非常有限而不被流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，原位染

9、色可以提供有效的幫助。 本實(shí)驗(yàn)的目的是擴(kuò)增結(jié)核患者HLA ClassⅡ β鏈(DRB)全長(zhǎng)序列，測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)；同時(shí)復(fù)蘇能分泌表達(dá)HLA DR/MTB肽復(fù)合物單體的果蠅S2恒定細(xì)胞株，經(jīng)誘導(dǎo)大量分泌表達(dá)蛋白，純化濃縮后獲得已生物素化的HLA DR/肽單體復(fù)合物，與熒光素標(biāo)記的鏈霉親和素按8：1的比例混合成制備成HLA DR/肽四聚體，以流式細(xì)胞技術(shù)分析四聚體陽(yáng)性的結(jié)核多肽特異性CD4+T細(xì)胞在標(biāo)本中的的比例。同時(shí)，對(duì)H

10、LA DR/肽四聚體做組織切片的原位染色，應(yīng)用CLSM分析觀察HLA DR/肽四聚體與特異的T細(xì)胞結(jié)合部位的熒光圖像以及所處微環(huán)境，為進(jìn)一步探索結(jié)核多肽/HLA DR四聚體技術(shù)在結(jié)核實(shí)驗(yàn)診斷和研究上的應(yīng)用以及結(jié)核疫苗開(kāi)發(fā)等建立基礎(chǔ)。 研究?jī)?nèi)容和方法： 分離活動(dòng)性結(jié)核患者胸水(PLF)和外周血(PBMC)標(biāo)本中的淋巴細(xì)胞，提取其總RNA，利用Switch Mechanism At 5’—end of Reverse Tra

11、nscript(SMART)逆轉(zhuǎn)錄獲得全長(zhǎng)cDNA，并通過(guò)LD PCR合成互補(bǔ)鏈。根據(jù)GenBank已有HLA—DRB序列分別設(shè)計(jì)能擴(kuò)增包括HLA ClassⅡDR β鏈先導(dǎo)序列起始密碼和終止密碼的上下游引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得完整的HLA ClassⅡDR β鏈(DRB)編碼序列。PCR回收產(chǎn)物連接入pGEM—Teasy載體，藍(lán)白篩選得到陽(yáng)性克隆，委托公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用DNAstar分析軟件及網(wǎng)上資源進(jìn)行分析、比對(duì)，得到不同的等位基

12、因，進(jìn)行分析。 復(fù)蘇穩(wěn)定分泌表達(dá)HLA DR/MTB肽復(fù)合物單體的果蠅S2恒定細(xì)胞株，經(jīng)過(guò)大量誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化后，濃縮HLA DR/MTB肽單體復(fù)合物蛋白，并將HLA DR/MTB肽單體復(fù)合物蛋白與藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素(PE—Streptavidin，PE—SAV)按8：1比例藕合構(gòu)建成帶熒光素標(biāo)記的四聚體，與結(jié)核患者的外周血淋巴細(xì)胞共孵育，再加入anti—CD4-FITC，送檢作流式細(xì)胞術(shù)分析。同時(shí)，取制備的四聚體和

13、結(jié)核患者的肉芽腫組織做冰凍切片，CLSM分析觀察HLA DR/肽四聚體與特異的T細(xì)胞結(jié)合部位的熒光圖像以及所處微環(huán)境。 結(jié)果： 本實(shí)驗(yàn)分別從14位活動(dòng)結(jié)核患者外周血或3位結(jié)核患者胸水標(biāo)本中擴(kuò)增出了完整的HLA ClassⅡ DR β鏈(DRB)編碼序列，共得到89個(gè)陽(yáng)性質(zhì)?？寺?，經(jīng)過(guò)序列分析比對(duì)，最終獲得4種不同的HLA DRB等位基因的克隆，其中等位基因HLA—DRB1*08032從17個(gè)病人中共獲得86個(gè)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒

14、，占克隆質(zhì)?？倲?shù)的96.63％，其余的等位基因HLA—DRB1*1605、HLA—DRB1*13KM、HLA—DRB1*131分別從不同的3個(gè)病人擴(kuò)增中獲得。 制備3株HLA DR/MTB四聚體，刺激7個(gè)結(jié)核患者的外周血淋巴細(xì)胞，做四聚體濃度梯度分析，流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示1.7mg/ml是大多數(shù)HLA DR/MTB四聚體結(jié)合CD4+T細(xì)胞較理想的濃度。此時(shí)，CD4+T細(xì)胞約占淋巴細(xì)胞總數(shù)的50.2％～64.3％，其中HLA DR

15、/MTB肽四聚體陽(yáng)性的CD4+T細(xì)胞占0.1％～10.4％。同時(shí)，CLSM對(duì)病理組織切片染色觀察發(fā)現(xiàn)，鏡下呈紅色的HLA DR/MTB肽四聚體，呈綠色的CD4+T細(xì)胞，在兩者的結(jié)合部位，呈現(xiàn)黃色。 結(jié)論： 1.采用SMART和LD—PCR的技術(shù)方法克服樣本量小的問(wèn)題，擴(kuò)增出了完整的HLA Class Ⅱ DR β鏈(DRB)編碼序列，為HLA Class Ⅱ基因的多態(tài)性調(diào)查研究提供了有用的價(jià)值。 2.從同一結(jié)核

16、患者標(biāo)本中擴(kuò)增到不同的HLA DRB等位基因，不同的標(biāo)本之間也擴(kuò)增到相同的HLA DRB等位基因，其結(jié)果顯示HLA—DRB1*08032等位基因在標(biāo)本擴(kuò)增中出現(xiàn)的頻率高于其他等位基因，提示該基因可能與結(jié)核易感性有相關(guān)性聯(lián)系。 3.成功制備3株HLA DR/MTB四聚體用于刺激結(jié)核患者的外周血淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析了結(jié)核患者特異性免疫(四聚體陽(yáng)性)CD4+T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的比例；CLSM技術(shù)觀察到鏡下HLA DR/MTB肽四聚