MHC-肽四聚體技術(shù)在CTL表位鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、MHC-肽四聚體(Peptide-MHC tetramer)技術(shù)是免疫學(xué)和臨床診斷中重要的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究及免疫性疾病臨床研究。研究證實(shí)，T細(xì)胞是通過(guò)TCR識(shí)別靶細(xì)胞或抗原遞呈細(xì)胞表面MHC分子結(jié)合的特異性表位肽復(fù)合體，但這種特異性識(shí)別親和力低，迅速發(fā)生解離。MHC-肽四聚體復(fù)合物的原理是通過(guò)增強(qiáng)T細(xì)胞受體與MHC-肽復(fù)合物親和力，達(dá)到可直接特異性檢測(cè)T細(xì)胞的目的。該法的優(yōu)勢(shì)在于迅速、直接、靈敏且特異性強(qiáng)，但也存在復(fù)性率低、步

2、驟繁瑣等缺點(diǎn)。雖然研究者對(duì)MHC-肽四聚體的制備技術(shù)做了很多改進(jìn)，但仍未很好地解決這些問(wèn)題。 MHC-I分子限制性的CTL表位鑒定一直是免疫學(xué)的熱點(diǎn)，是基于表位進(jìn)行免疫診斷、免疫治療、疫苗開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的CTL表位鑒定方法主要采用先合成大量的交疊肽，再通過(guò)后續(xù)淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選取，存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)用大、鑒定效率低等缺點(diǎn)。有研究者用TAP(Transporters associated with antigen proces

3、sing)缺陷細(xì)胞T2細(xì)胞，采用肽親和力實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表位鑒定，取得了很好的結(jié)果，但繁瑣的標(biāo)記、染色及反復(fù)洗滌細(xì)胞過(guò)程可能對(duì)細(xì)胞造成的損傷是限制該方法廣泛應(yīng)用的主要原因。 眾所周知，DsRed和ZsGreen均表達(dá)為四聚體結(jié)構(gòu)的熒光蛋白，所以，我們?cè)O(shè)想將MHC-I分子和ZsGreen在真核細(xì)胞中融合表達(dá)，直接獲取MHC-四聚體，簡(jiǎn)化傳統(tǒng)制備MHC-四聚體中繁瑣的原核表達(dá)、折疊、生物素化、熒光標(biāo)記等過(guò)程，且構(gòu)建的MHC-四聚體理論上可加

4、載任意感興趣的抗原肽，使檢測(cè)更加靈活。而運(yùn)用此原理將β2M和ZsGreen融合表達(dá)獲得β2M四聚體，該融合蛋白理論上可以和MHC-I、特異性表位肽結(jié)合形成MHC-肽四聚體。利用此原理，將此融合蛋白應(yīng)用于肽親和力實(shí)驗(yàn)，可能極大地改進(jìn)CTL表位鑒定方法。 目的： 本研究試圖運(yùn)用分子克隆技術(shù)、真核表達(dá)、鎳親和層析法純化等方法直接獲得MHC-四聚體，優(yōu)化MHC-肽四聚體制備技術(shù)，并將該技術(shù)運(yùn)用于MHC-肽親和力實(shí)驗(yàn)，改進(jìn)CTL表

5、位鑒定方法。 方法： 1．通過(guò)PCR技術(shù)得到小鼠MHC-I分子的可溶性部分sKb的DNA序列，并運(yùn)用分子克隆技術(shù)將這段DNA片段與4×GGGS-ZsGreen-6×His載入包裝質(zhì)粒FUGW的載體中，構(gòu)建sKb-GGGS-ZsGreen-6×His標(biāo)簽的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒FUsKbZsGreenGGGS； 2．運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將FUsKbZsGreenGGGS轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，融合表達(dá)sKbZsGreenG

6、GGS； 3．裂解表達(dá)sKbZsGreenGGGS的293FT細(xì)胞，利用融合蛋白所帶的6×His標(biāo)簽，鎳親和層析法純化sKbZsGreenGGGS，并脫鹽、濃縮； 4．將sKbZsGreenGGGS和β2M、OVA肽組裝后得到MHC-OVA肽四聚體，該四聚體與B3Z細(xì)胞反應(yīng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)； 5．通過(guò)PCR技術(shù)得到人β2M分子的DNA序列，并運(yùn)用分子克隆技術(shù)將這段DNA片段與4×GGGS-ZsGreen-6×Hi

7、s載入包裝質(zhì)粒FUGW的載體中，構(gòu)建β2M-GGGS-ZsGreen-6×His標(biāo)簽的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒FUβ2MZsGreenGGGS； 6．運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將FUβ2MZsGreenGGGS轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，將β2M-GGGS-ZsGreen-6×His片段嵌入293FT細(xì)胞基因組DNA，融合表達(dá)β2MZsGreenGGGS； 7．裂解表達(dá)β2MZsGreenGGGS的293FT細(xì)胞，利用融合蛋白所帶的6×Hi

8、s標(biāo)簽，鎳親和層析法純化β2MZsGreenGGGS，并脫鹽、濃縮； 8．將β2MZsGreenGGGS和表位肽共同與TAP缺陷細(xì)胞T2細(xì)胞反應(yīng)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T2細(xì)胞標(biāo)記綠色熒光的情況鑒定表位，并與傳統(tǒng)肽親和力實(shí)驗(yàn)對(duì)比。 機(jī)制探討： 1．MHC-肽四聚體技術(shù)的優(yōu)化 通過(guò)將MHC-I分子和ZsGreen融合表達(dá)，直接構(gòu)建帶綠色熒光的MHC-I四聚體，將該四聚體與特異性表位肽結(jié)合后與特異性雜交瘤細(xì)胞反應(yīng)

9、，流式細(xì)胞檢測(cè)，通過(guò)細(xì)胞染色比例證實(shí)所構(gòu)建的MHC-I四聚體復(fù)合物可被特異性T細(xì)胞識(shí)別、結(jié)合，對(duì)MHC-肽四聚體復(fù)合物技術(shù)的優(yōu)化的方法可行。本部分研究利用真核表達(dá)、蛋白質(zhì)純化技術(shù)獲得MHC-I四聚體，與特異性表位肽及特異性T細(xì)胞反應(yīng)后流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)該四聚體具有與特異性表位肽結(jié)合并被特異性T細(xì)胞識(shí)別的能力。 2．MHC-肽四聚體技術(shù)在表位鑒定中的應(yīng)用 將β2M和ZsGreen融合表達(dá)，獲得帶綠色熒光蛋白的β2M四聚體，將該

10、四聚體與不同的表位肽、T2細(xì)胞反應(yīng)，流式細(xì)胞檢測(cè)，根據(jù)T2細(xì)胞染色情況鑒定抗原表位。本部分實(shí)驗(yàn)運(yùn)用T2細(xì)胞株TAP(Transporters associated with antigen processing)缺陷的特點(diǎn)及β2M促進(jìn)MHC I類分子與抗原表位肽結(jié)合的作用，將β2M四聚體、表位肽及T2細(xì)胞反應(yīng)，陽(yáng)性肽與β2M四聚體、T2細(xì)胞表面少量MHC-1分子結(jié)合形成穩(wěn)定的帶綠色熒光的MHC-肽四聚體復(fù)合物，同時(shí)在T2細(xì)胞表面標(biāo)記綠色

11、熒光，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)即可鑒定表位。 結(jié)論： 1．構(gòu)建了1種MHC-I四聚體的真核表達(dá)質(zhì)粒FUsKbZsGreenGGGS并表達(dá)、純化得到sKbZsGreenGGGS，將sKbZsGreenGGGS和β2M、OVA肽組裝后被B3Z細(xì)胞識(shí)別、結(jié)合，流式細(xì)胞檢測(cè)； 2．構(gòu)建了β2M-四聚體的真核表達(dá)質(zhì)粒FUβ2MZsGreenGGGS并表達(dá)、純化得到β2MZsGreenGGGS，將β2MZsGreenGGGS與表位肽共