HLA-A2-肽四聚體的制作及其在人工抗原提呈系統(tǒng)中的實驗研究.pdf

1、MHCI類/肽四聚體技術的報道開創(chuàng)了抗原特異性 T 細胞檢測和分析的新紀元。十年來其應用范圍已擴展至幾乎所有涉及細胞免疫的基礎和臨床性研究領域。但制作程序繁雜、成本昂貴、生產(chǎn)得率很低的問題也一直阻礙著它的應用。在諸多的技術改進中，將抗原肽與β2m融合而制作由兩個亞單位(2C)組成的HLAI類/肽復合體及其熒光四聚體的策略被報道。盡管其制作成本明顯下降，但多年來應用很少。原因之一是缺乏系統(tǒng)比較2C型和傳統(tǒng)3C型HLAI類/肽復合體的結構和

2、功能性特征的信息。在諸多的應用性研究中，可溶性MHCl類/肽復合體及其多聚體被用來制作磁珠式和膠乳微球式人工抗原提呈細胞(aAPCs)。盡管這兩種aAPCs在體外擴增抗原特異性T細胞的能力已被充分證實，但是其在體內(nèi)誘導抗原特異性T細胞反應的潛能卻少有報道。鑒于在體外擴增的特異性CTLs進入體內(nèi)后經(jīng)常達不到預期的過繼治療效果，因此進一步研究aAPCs在體內(nèi)主動免疫治療中的潛力很有必要。 本研究在三方面開展了工作：建立了可溶性HLA

3、I類/肽復合體及其熒光四聚體的制作技術：利用抗原肽-β2m融合策略制備了2C型HLA-A2/MARTl<,27-35>復合體及其四聚體，系統(tǒng)地比較了其與傳統(tǒng)3C復合體的結構和功能性特征：利用2C和3C型HLA-A2/肽四聚體制作了膠乳微球式aAPCs，在naive小鼠體內(nèi)有效誘導了腫瘤抗原特異性的CTL反應。結果如下： (1)2C、3C型HLA-A2/MARTl<,27-35>復合體和3C型HLA-A2/HER2/neu<,36

4、9-377>復合體制備：三種重組質(zhì)粒pET28a-HLA-A<'*>0201(α1-α3)．BSP、pET28a-MARTl<,27-35>-Linker-hβ2m和pET28a-hβ2m被成功構建、表達、純化和鑒定。HLA-A2重鏈和輕鏈融合蛋白以及人工合成的．MARTl<,27-35>和HER2/neu<,369-377>抗原肽在體外被組裝折疊、生物素化，然后在FPLC系統(tǒng)中經(jīng)Superdex 75凝膠層析柱過濾純化。FPLC洗脫圖

5、顯示有四個洗脫峰。SDS-PAGE和Western blot分析證實第一洗脫峰是HLA-A2/肽單體復合物的蛋白峰；HLA-A2重鏈羧基端的His6生物標簽未明顯影響前者的生物素化效率和四聚體的制備；另外，質(zhì)譜分析顯示起始密碼子編碼在MARTl<,27-35>肽N端的甲硫氨酸可能在原核表達中已被切除。 (2)2C和3C型HLA-A2/MARTl<,27-35>復合體的生化及結構性特征比較：FPLC洗脫圖及其SDS-PAGE和We

6、stern blot分析證實：2C型HLA-A2/MARTl<,27-35>單體的分子大小、層析規(guī)律等與3C型單體基本一致。但相同條件下前者的折疊效率是后者的2.5倍；ELISA和DDIA實驗顯示，盡管2C和3C型HLA-A2/MARTl <,27-35>單體均能與單抗W6/32(HLA I類分子構象特異性)和CRll-351(HLA．A2分子構象特異性)以及可溶性受體scFv8.3(HLA.A2/MARTl<,27-35>復合體構象特

7、異性) 呈強烈的特異性的結合反應，但是前者與W6/32和CR11-351的結合力顯著低于其3C型復合體(p<0.05，p<0.01)，而與scFv8.3的反應性卻顯著高于其3C型復合體(p<0.05)；四聚體染色分析黑色素瘤浸潤淋巴細胞群TILl和TlL2顯示，2C和3C型JLA-A2/MARTl<,27-35>四聚體均能特異性地與膜受體TCR結合，但2C型四聚體在各個劑量組所檢測到的tetramer<'+>/CD8<'+>細胞頻率總是

8、比3C型四聚體所測的頻率稍高。這種差別在MARTl特異性T細胞較多的TIL2細胞群的染色中尤其明顯；穩(wěn)定性分析提示，2C和3C HLA-A2/MARTl<,27-35>四聚體至少在25<'O>C高溫條件下的解離速度是相當?shù)摹?(3)2C和3C型HLA-A2/MARTl<'27-35>復合體激發(fā)抗原特異性CTL增殖和殺傷的功能比較：2C和3C HLA-A2/MARTl<'27-35>單體復合物分別與TILl細胞群共孵育 3 周后，

9、熒光四聚體染色分析顯示，2C與3C單體均能特異性地、有效地刺激MARTl<,27-35>表位特異性CTL增殖，且增殖頻率相當：未刺激組的tetramer<'+>/CD8<'+>細胞頻率為0.89﹪，2C和3C單體刺激組則分別升高至3.60﹪和3.02﹪；<'51>Cr釋放實驗顯示，2C或3C單體刺激的TILl細胞群均能對黑色素瘤細胞株501和MARTl<,27-35>多肽脈沖的T2靶細胞發(fā)揮強烈的特異性殺傷作用，即使在低劑量刺激組，殺傷

10、比率也明顯高于未刺激組(p<0.001)。但是，2C單體刺激的TILl細胞群在各個效/靶比例組中溶解靶細胞的能力均明顯高于被3C型單體刺激的TILl細胞群(p<0.01)。 (4)膠乳微球式aAPCs在鼠體內(nèi)誘導腫瘤抗原特異性CTL活化、增殖和殺細胞反應：HLA-A2/K<'b>轉(zhuǎn)基因小鼠被膠乳微球式aAPCs免疫接種三次后，其脾細胞在體外被相應的抗原肽刺激1-3天，而后進行細胞內(nèi)IFN-γ染色、HLA-A2/肽四聚體染色和細胞

11、膜CD69分子的流式分析以及細胞毒殺傷實驗等。結果顯示：兩種由HLA-A2/肽四聚體和抗鼠CD28單抗共同包被的膠乳微球式aAPCs即使在naive小鼠體內(nèi)，仍然能夠有效地誘導腫瘤抗原特異性cTL活化和增殖至對照組小鼠的5-6倍；而且能夠有效激發(fā)鼠CTL對人腫瘤靶細胞的特異性識別和殺傷，殺傷率在不同效：靶比例處均明顯高于未接種組的鼠脾細胞。 這些結果提示：抗原肽-β2m融合的2C型HLA I類/肽復合體是傳統(tǒng)3C型復合體的可信替