hla-a2肽四聚體的構(gòu)建及其在乙、丙型肝炎中的初步應(yīng)用

1、· l 8 l 8 ·2 0 0 4 年 1 1 月 2日第 8 4卷第 2 l 期 N a t lM e dJC h iv e m b e r2 , 2 0 0 4 , V o l8 4 , N o ． 2 1H L A — A 2 肽 四聚體的構(gòu)建及其在乙、 丙型 肝炎 中的初步應(yīng)用 樸文花 何豫 席宏麗 孫新婷 張恒輝 徐京航 趙鴻 許文燮 李在琉 王貴強(qiáng) 【 摘要】目 的 分別構(gòu)建乙型肝炎病毒( H B V

2、) 和丙型肝炎病毒( H C V ) 特異的H L A - A 2 肽四聚體 ， 為檢測乙、 丙型肝炎患者體內(nèi)特異性的細(xì)胞毒 T細(xì)胞 ( C T L ) 提供直接、 有效的方法 ， 指導(dǎo)臨床用 藥。方法 分別構(gòu)建含有 H L A - A 2 · B S P ( 含有 1 5 個可供識別生物素化的氨基酸位點(diǎn)) 和 p 2 微球蛋 白( [ 3 - 2 m) 基因的原核表達(dá)載體 ， 并進(jìn)行表達(dá)、 復(fù)性、 鑒定及純化。再分別將 H

3、B V和 H C V特異性短肽與 H L A — A 2 - B S P和 B ． 2 m蛋白在體外進(jìn)行耦合 ， 該復(fù)合物經(jīng)純化濃縮后進(jìn)行生物素化。生物素化的產(chǎn)物 經(jīng)純化濃縮后形成單體 ， 此單體再與藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素按一定比例耦合構(gòu)建成四聚體， 最后 進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測 。結(jié)果 獲得了高效、 穩(wěn)定的 p B V 2 2 0 · H L A - A 2 - B S P和 p B V 2 2 0 - [ 3 - 2 m原核

4、表達(dá)載 體 ， 表達(dá)量分別占菌體的4 6 ％和2 6 ％左右； 純度達(dá)9 0 ％以上。構(gòu)建的四聚體可成功的檢測急、 慢性 乙型和丙型肝炎患者中特異性的 C T L ， 急性 H B V感染時 C T L占 1 ． 8 4 ％ ， 慢性 H B V感染時 C T L占0 ． 0 2％ ～ 0 ． 6 8 ％ ， 慢性 H C V感染的 C T L占0 ． 0 2～ 0 ． 7 2 ％。結(jié)論 高效 、 穩(wěn)定 的 p B V 2 2 0 -

5、H L A - A 2 · B S P和 p B V 2 2 0 - [ 3 - 2 m原核表達(dá)載體大量的表達(dá)可用于構(gòu)建各種肽特異性 的四聚體復(fù)合物； 在體 外構(gòu)建 的M H C- I 類分子四聚體， 為特異性細(xì)胞毒 T 細(xì)胞的檢測提供有效的工具。【 關(guān)鍵詞】肝炎病毒 ， 乙型； C型肝炎樣病毒屬；H L A - A 2 抗原 ； T淋巴細(xì)胞， 細(xì)胞毒性 Co n s t r u c t i o no fHLA． A2 - p

6、 e p t i d et e t r a me ra n da p p H e a t i o ni n 皿 V／ HCV i n f e c t i o nD ．h u a ‘， H EY u ， X IH o n g - l i， s U NXt i n g， z H A N GH e n g - h u i ， X Uj i | l g - h a n g， z H A 0H o n g ， X UW e n - x i e

7、 ， L IZa i - Z。4 ^ r GG u i ． q i a n g ．’ Pe k i n gU n i v e r s i t yFi r s tHo ~i t d，，1 0 0 0 3 4， C h i n aC o r r e s p o n d i n g a u t h o r ：A J 7 、 r GGu i — q i a n g ．Ema i l ：w a n g g q @ h o t ma i l ．

8、c o r n 【 A b s t r a c t 】 0 b j e c t i v eT oc o n s t r u c tH B Va n dH C V - s p e c i f i cH L A - A 2 - p e p t i d et e t r a m e r s ， a n dt od i r e c tc l i n i c a lt h e r a p y ． Me t h o d sR e c o mb i

9、n a n tc l a s sIHLA． A 2h e a v yc h a i n sa n dB- 2M w e r e p r o d u c e di nE s c h e r i c h i ac o l ic e n st r a n s f o r me dw i t hp B V2 2 0v e c t o r s ．On l yt h ee x t r a c e l u l a rd o ma i no fc

10、l a s sIh e a v y c h a i nw a se x p r es s e d 。 f o l l o w i n gm o d i f i c a t i o nb yr e p l a c e me n to ft h eC ． t e r m i n a ld o m a i nw i t has u b s i r a t es e q u e n c ef o rB i r Ab i o t i n y l

11、 a t i o n ．HL A． A2 ． B S Pwa sf o l d e d i nt h ep r es e n c eo fB- 2mi c r o g l o b u l i na ndas p e c i f icp e p t i d et of or m ap e p t i d e - MHCc o mp l e x ． T h eMHCc o mp l e x e swe r eb i o t i n y

12、l a t e d u s i n gp u r i f i e d B i r Ae n z y me ．B i o t i n y l a t e dMHC- p e p t i d ec o mp l e x e sw e r ep u r i f i e d ．Te t r a me r s we r e g e n e r a t e db ymi x i n gb i o t i n y l a t e dp r o t

13、 e i nc o mp l e xwi t l ls t r e p t a v i d i n ． P E a tat oo l a l “ r a t i oo f 4： 1 ．T h e na n a ly s i so f s t a i n e dP B MCsw a sp e r f o r m e du s i n gF A C S c a n a ndC e l Q u e s ts o f t w a r e

14、． R e s u l t sT hee x p r e s s i o nl e v e l so fp B V 2 2 0 ． H L A ． A 2 ． B S Pa ndB - 2 Mw e r e4 6％ a n d4 8 ％ o f t o t a lb a c t e r i a l p r ot e i n se s t i ma t e d f r o m S DS — P AGE．r e s p e e t

15、 i v e l y ．An dt h e ywe r e ma i n l yl o c a t e d i nt hei n s ol u b l ef r a c t i o no f t h ec e l la si n c l u s i o nb o d i e sa n dt hep r op e r t i o nw e r e a b o u t8 5％ a n d9 O ％ ．r es p e c t i v

16、e l y ．T h ep u r i t yo fp B V 2 2 0 - HI A ． A 2 ． B S Pa nd [ 3 - 2 Mw a sa b o v e9 5 ％ a na l y z e d b yS D S ． P A G E．a(chǎn) n dt hec o n c e n t r a t i o no f p B V 2 2 0 - HL A - A 2 一 B S Pa nd[ 3 - 2 M w a sa

17、b o u t1 ． 5La nd1 ． 2L。 r es p e e t i v e l y ．U s i n gt hec o n s t r u c t e d HL A． A 2- p e p t i d et e t r a me rt od e t e c tt heHBV ／HC V． s p e c i f icC T L．t heHBV． s p e c i f icC D8f r e q u e n c i e s

18、we r e1 ． 8 4 ％ a n d0 ． 0 2 ％ ～0 ． 6 8 ％ o ft het o t a lCD8Tc e lsi na c u t ea ndc h r o n i cHB V h e p a t i t i s 。r es p e c t i v e l y ．Asa n a d d it i o n a l c o n t r o l ，a nHL A- A2 ／HC V t e t r a me

19、rwa st ~t e d i nt hea c u t ea n dc h r o n i cHBVh e p a t i t i s ．T h ef r eq u e n c i e sn e v e re x c e e d e d0 ． 0 2 ％ o f t het o t a lCD8Tc e ln u mb e r ． S i mi hrl o w l e v e l so f b a c k g r o u n

20、ds t a i l l i n gwe r ea ls od e t e c t e di nt heHL A． A 2o rA 2一h e a lt hyc o n t r o 1 ．T h eHC V．基金項(xiàng) 目： 衛(wèi)生部臨床學(xué)科重點(diǎn)項(xiàng) 目 基金資助項(xiàng) 目( 2 0 0 1 0 9 1 1 ) ； 北京大學(xué) 9 8 5青年基金資助項(xiàng)目； 美國C M B基 金資助項(xiàng) 目作者單位： 1 0 0 0 3 4北京大學(xué)第一醫(yī)院感染疾病科(

21、樸文花、 何豫、 席宏麗、 孫新婷、 張恒輝、 徐京航、 趙鴻、 王貴 強(qiáng)) ； 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院( 樸文花、 許文燮、 李在琉)通訊作者： 王貴強(qiáng)， E m a i l ： w a n g g q @h o t m a i l ． o 0 I n． 臨 床 論 著 ·維普資訊 http://www.cqvip.com 2 日第 8 4 囂第 2 l蚓 N a dMe dJC h in H ，v口 山 2 ， 2 1 k 9 4

22、 ，!—者的復(fù)合體 復(fù)合體用透析袋挾成生物素化緩沖液 ( 1 0 0m m o l ／ Lp H8 ． 0T B S緩沖液中含有： 5m m o l ／ LMg C I ， ； 1 ~ mo l ／ Ll e u p e p t i n； 1I t mo l ／Lp e p s t a t i nA：1 0 0I J ． m o l ／ LP M S F ； 5m m o L e lA T P )在含有復(fù)合體 的生物素 化溶液 中加入

23、4 0 0p ． m o l ／ LD — b i o t i n和 2m g ／ LB i r A ， 放置室溫 1 6～ 2 0h再經(jīng) s e p h a c u ' l - 3 0 0凝膠過濾換液成 p H 8 ． 0T r i s 緩 沖液， 濃縮 。最后上 M o n oQ柱， 得到 M H C ／ 肽單體。M H C ／ 肽單體與藻 紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親 和素( s t r e p t a v i d i n — P

24、E ) 按摩爾 比4 ： 1比例( 4 ℃． 避光) 混合即形成 M H C 一 肽四聚 體 ( 2 ) P B M C的分離 ： 取 l 0m l 抗凝的靜脈血緩慢 加入等量的淋 巴細(xì)胞分層液中 ， 1 5 0 0r ／ r a i n 室溫離 I , , 2 0r a i n ， 小心地取單核細(xì)胞層， P B S 洗 3 次。汁 數(shù) 單個核細(xì)胞。( 3 )H L A — A 2 型別鑒定： 取 l ×1 0個 P B M

25、C與 1 0 0l 鼠抗人 H L A — A 2 單抗4 ℃共孵育3 Or a i n ， 加 】 0 0l 羊抗 鼠 t g G — F I T C ． 4 ℃ 避光 反應(yīng) 3 0r l l i n ， 2P B S洗3遍 最后用 1 ％ 多秉甲醛 3 0 0重懸固定， 行流式細(xì)胞儀檢測 ( B e c t o n — D i c k i n s o n ) 。同時每份標(biāo)本均設(shè)自身陰性對照 ( 4 )四聚體標(biāo)記與流式檢測 ：用完全

26、R P M I1' 6 4 O調(diào) 節(jié) P B M C數(shù)量 為 l × 1 0， 與 5四聚體于室溫避光反應(yīng)3 0r a i n ． 用 P B S洗兩遍 5 0P B S 重懸細(xì)胞 ， 加人 5IF I T C標(biāo) | 己 的抗 C D 8 抗體 ， 避光 ，4 ℃反應(yīng) 3 0r a i n ． ． 用 P B S 洗滌細(xì)胞兩 次。最后以 3 0 0lP B S重懸 細(xì)胞沉 淀 ， 行流式細(xì)胞儀檢測 ， C e l l

27、— Q u e s t 軟 件分析 ， 檢測 C D 8和四聚體 雙 陽性 細(xì)胞的比率 若不能及時檢測 ， 則以3 0 01 ％ 多聚 甲醛重 懸 固定 ， 避 光， 4 = C 放置， 8h內(nèi)檢測。每例患者 標(biāo)本均設(shè)各自同型對照。對于乙肝 患者， 采用 H I l ^ 一 A 2 ／ H C V四聚體標(biāo) 記作 為 陰性對 照。反之 ， 對丙 肝 患 者 ， 采 用 H L A - A 2 ／ H B V 四聚體作 為 陰性對照 結(jié)

28、果 1 ．H L A — A 2 一 B S P 和 1 3 — 2 M基因的 擴(kuò)增及鑒定 ： P C R和 雙酶 叨反應(yīng)進(jìn) 行初步鑒定 ， 結(jié)果顯示擴(kuò)出和切出大 小合適的片段， 表明獲得陽性重組體 ( 圖 1 ) 。將陽性重組體進(jìn)行測序 ， 測 序結(jié)果用 N C B I 的 B L g , S T程序分析，b p2 0 0 01 1 3 0 07 5 05 0 02 5 0結(jié)果表明獲得的 H L A — A 2及 - 2 M序列同 G

29、 e n B a n k中登錄的序列一致 2 ．重組蛋白的表達(dá)及可溶性分析 ： 重組菌經(jīng) 溫度誘導(dǎo)及 S D S — P A G E分析． H L A · A 2 一 B S P和 1 3 - 2 M分別在分子量約 3 30 0 0和約 1 20 0 0處各有一條新 # 的表達(dá)帶( 圖2 ) ， 同預(yù)期的一致．經(jīng)灰度掃描分 析， 其中p B V 2 2 0 一 H L A — A 2 - B S P的表達(dá)量占全菌體的4 6 ％

30、， p B V 2 2 0 — 1 3 2 一 M 的表達(dá)量 f全菌體 的 2 6 ％ 左 右 以超聲波裂解菌體， 離心取上清和沉淀， 進(jìn)行 S D A — P A G E分析， 表明表達(dá)產(chǎn)物大多數(shù)在 ( 8 5 ％以上 ) 沉淀中， 說明 H L A — A 2 - B S P投 B 一 2 M蛋 白均主要 以包 涵 體 的 形 式 存 在 于 細(xì) 菌 細(xì) 胞 內(nèi) ( 圖 2 ) 。W e s t e r nb l o t 結(jié)果顯 示

31、， 分別在 H L A — A 2和 p 一 2 M相 對應(yīng)位置處見強(qiáng)雜交帶。3 ．表達(dá)產(chǎn)物 的純化 ： 經(jīng) G o l d k e y軟件分析 H L A — A 2 一 B S P和 B 2 一 M的等電點(diǎn) P 1 分別約 為53 O和 6 ． 3 0 ， 故采用陰離子交換層析純化 ： ． 包涵體先后 經(jīng) S - S e p h a r o s eF F 、 Q — S e p h a r o s eF F和 G 一 5 0拄純化

32、，最 后用 超濾器濃縮 ． S D S — P A G E 分析表 明純化效果 M 1234567M I 一 2 0 0 0／ 】 0 0 0— 7 5 0～ 5 0 0— 2 5 0— 1 0 0M ．標(biāo)準(zhǔn) 參照物 ． 1H J J ^ 一 A 0 2 0 1 - B S P的 P C R產(chǎn) 物 ． 2p B V 2 2 0 一 H L A - A 0 2 0 1 一 B S P3p B V 2 2 0H l l AM ) 2

33、 0 tB S P用 E 脅R1 和 S a l 1 雙酶切產(chǎn)物 ，p B V 2 2 0 一 B 0m5p B V 2 2 0 一 f i - 2 m用 X n m1 和 B 曲 I 雙酶切產(chǎn)物 ． 6 、 7B 之 n l 的 P c R產(chǎn)物 圖 1 重組 p B V 2 2 0 一 } u l ^ 一 A 0 2 0 【 一 B S P和 p B V 2 2 0 一 p - Z - M 的跟制 比酶 山鑒定 和 P C R相對分子