應(yīng)用二硫鍵捕獲型單鏈三聚體技術(shù)制備PR1-HLA-A-0201四聚體.pdf

1、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic TLymphocytes，CTL)是機(jī)體抗腫瘤、抗移植物及有效控制各種感染的重要免疫防御效應(yīng)細(xì)胞，定量檢測(cè)抗原特異性CTL一直是免疫學(xué)界努力目標(biāo)之一。
　　T細(xì)胞是通過TCR識(shí)別靶細(xì)胞或抗原遞呈細(xì)胞表面MHC分子結(jié)合的特異性表位肽復(fù)合體，但這種特異性識(shí)別親和力低，迅速發(fā)生解離。MHC-Ⅰ四聚體技術(shù)正是基于TCR與抗原肽-MHC-Ⅰ的特異性相互作用，利用生物素-親和素結(jié)合的原理，在體外將MHC-

2、Ⅰ分子及其所遞呈的抗原肽組裝成抗原肽-MHC-Ⅰ四聚體復(fù)合物。MHC-Ⅰ四聚體復(fù)合物增強(qiáng)了MHC-Ⅰ分子與T細(xì)胞受體的親和力，借助流式細(xì)胞技術(shù)可以對(duì)結(jié)合有抗原肽-MHC-Ⅰ四聚體的T細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和分離。但后來發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)四聚體制備流程復(fù)雜，成本高，加之復(fù)性效率低，特別是對(duì)于與MHC分子低親和力的抗原肽，極難形成穩(wěn)定的pMHC-Ⅰ單體，這些缺陷限制了四聚體技術(shù)的應(yīng)用。
　　MHC-Ⅰ單鏈三聚體技術(shù)(single chain trimer

3、，SCT)的出現(xiàn)一舉解決了上述問題，它是將抗原肽、β2m和MHC-Ⅰ分子以適當(dāng)?shù)慕宇^(linker)依次串聯(lián)而成，只需克隆表達(dá)一次，純化一次，大大簡(jiǎn)化了制備過程，而且得率較傳統(tǒng)四聚體高得多，大大降低了成本。更為重要的是，MHC-Ⅰ SCT可以使抗原肽與MHC分子的結(jié)合更加穩(wěn)定，本質(zhì)上是增加了一個(gè)再結(jié)合的過程，是一個(gè)補(bǔ)償效應(yīng)，這使得四聚體技術(shù)的使用范圍擴(kuò)大至某些與MHC分子較低親和力的抗原肽。但是，如果抗原肽與SCT的抗原結(jié)合槽的結(jié)合能力

4、低到一定程度，也會(huì)有被取代的危險(xiǎn)。出于這方面的考慮，我們對(duì)SCT進(jìn)行了改進(jìn)，引入“二硫鍵”，使得抗原肽更牢固地錨定在抗原結(jié)合槽內(nèi)。
　　慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種髓系造血干細(xì)胞惡性增生性疾病，目前仍缺乏有效的根治方法，過繼性細(xì)胞免疫治療成為了理想的方法。PR1為來自CML相關(guān)抗原蛋白酶3的HLA-A*0201限制性9肽(VLQELNVTV)，其誘導(dǎo)的CTLs可殺傷白血病細(xì)胞，

5、但對(duì)正常骨髓細(xì)胞無毒性。本實(shí)驗(yàn)改造的PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚體旨在提高PR1特異性CTL的檢出率，期望成為CML研究中的有力工具。
　　本研究中，我們首先利用基因工程技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有的PR1-HLA-A*0201 SCT融合基因載體進(jìn)行改造，在PR1肽、β2m及HLA*0201以柔性linker依次串聯(lián)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用SOE-PCR的方法將A2分子的“肽C末端結(jié)合區(qū)”的第84位氨基酸由酪氨酸(Tyr)突變?yōu)榘腚装?/p>

6、酸(Cys)，同時(shí)在linker1中引入一個(gè)Cys，兩個(gè)半胱氨酸殘基形成一個(gè)二硫鍵，使抗原肽C末端更好地錨定，確?？乖暮涂乖Y(jié)合槽的穩(wěn)固結(jié)合。再將改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT融合基因，克隆到pET22b載體中進(jìn)行原核表達(dá)，通過洗滌包涵體獲得大量改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT包涵體蛋白。然后對(duì)改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT包涵體蛋白進(jìn)行純化、折疊復(fù)性、超濾截留，再將其生物素化，根據(jù)

7、生物素化效率，按照4.5∶1摩爾比和PE標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合，形成一個(gè)標(biāo)記熒光素的PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚體。
　　通過流式檢測(cè)CML臨床標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚體在PR1-CTL的檢出率上明顯優(yōu)于未改造的PR1-HLA-A*0201-SCT四聚體，并且治療后的CML病人體內(nèi)PR1-CTL的頻數(shù)要比未經(jīng)過治療的病人高，兩者存在顯著性差異。在對(duì)PR1-CTL這群特異性細(xì)胞的分析中發(fā)現(xiàn)