CCR3拮抗劑在實驗性角膜新生血管發(fā)生過程中的作用和機(jī)制.pdf

1、背景與目的：
　　正常角膜的透明性是維持良好視力的重要因素之一。當(dāng)炎癥、外傷、缺氧等因素破壞了促血管生成因子和抑制血管生成因子之間的平衡，促使血管從角膜緣長入角膜，是導(dǎo)致視力減退甚至盲目的一個主要原因。目前關(guān)于角膜新生血管(CRNV)的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子等炎癥介質(zhì)發(fā)揮的作用一直是研究關(guān)注的重點。
　　CC趨化因子受體3（CCR3）是一個G蛋白偶聯(lián)受體，主要表達(dá)在嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、Th

2、2淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，其中嗜酸性粒細(xì)胞高表達(dá)。既往研究CCR3的主要功能是募集白細(xì)胞（主要是嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞）至炎癥部位，參與過敏性疾?。ㄈ缦┑陌l(fā)病機(jī)制。此外，CCR3也表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并參與血管生成。而且CCR3信號在脈絡(luò)膜新生血管的發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。并參與角膜縫線法誘導(dǎo)小鼠角膜新生血管的生長，但CCR3信號在角膜新生血管中的表達(dá)及具體作用機(jī)制仍不明確。
　　堿燒傷誘導(dǎo)的 CRNV是一種被普遍認(rèn)可的

3、角膜新生血管的動物模型。為了明確CCR3信號在角膜新生血管中的表達(dá)及作用機(jī)制，本課題從建立小鼠堿燒傷CRNV模型著手，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測CCR3、Eotaxin mRNA在受損角膜組織中各個時間點上的表達(dá)。應(yīng)用角膜鋪片熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)觀察局部應(yīng)用CCR3小分子拮抗劑SB328437進(jìn)行早期干預(yù)后，對堿燒傷誘導(dǎo)的CRNV形成的影響。采用Real-time PCR和Western blot法從基因水平及蛋白水平檢測

4、并比較SB328437早期干預(yù)后角膜組織內(nèi)VEGF表達(dá)的變化，明確CCR3信號的作用機(jī)制。并應(yīng)用培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HREC），通過細(xì)胞增殖實驗和管腔形成實驗，進(jìn)一步證實CCR3信號在血管發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床治療新生血管性眼病提供了一定的理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1. BALB/c小鼠60只，以堿燒傷誘導(dǎo)CRNV模型，收集堿燒傷后0 d、2 d、4 d、7 d各時間點的角膜組織，以Real-time P

5、CR檢測堿燒傷誘導(dǎo)小鼠CRNV過程中角膜組織內(nèi)各時間點CCR3、Eotaxin mRNA的表達(dá)。
　　2. BALB/c小鼠60只，隨機(jī)分為實驗組和對照組。堿燒傷后立即予局部點眼干預(yù)：實驗組使用1μmol/ml CCR3拮抗劑，對照組使用0.2%透明質(zhì)酸鈉，每天3次，每次3μl，共干預(yù)1周。在角膜組織堿燒傷2周后，大體拍照初步觀察兩組角膜新生血管形成情況后處死小鼠并摘除實驗眼球，應(yīng)用角膜鋪片CD31熒光染色法檢測新生血管區(qū)域占整個

6、角膜的面積比例，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測角膜組織中CD31陽性細(xì)胞數(shù)目，觀察CCR3拮抗劑對堿燒傷CRNV形成的影響。
　　3. BALB/c小鼠60只，隨機(jī)分為實驗組和對照組：干預(yù)方法同前，堿燒傷后4 d，收集各組角膜組織，應(yīng)用Real-time PCR及Western blot法從基因水平和蛋白水平檢測各組角膜組織中VEGF的表達(dá)。觀測CCR3信號通路與角膜組織內(nèi)VEGF表達(dá)的相關(guān)性。
　　4. HREC細(xì)胞鋪于96孔培養(yǎng)板中

7、。隨機(jī)分為五組，分別以0.1μmol/ml，0.2μmol/ml，0.5μmol/ml，1μmol/ml的CCR3-antagonist干預(yù)，等量的PBS緩沖液作為對照。干預(yù)24 h后加入CCK8細(xì)胞增殖檢測液，分光光度儀450 nm波長下檢測各孔OD值。通過OD值計算和分析CCR3-antagonist對HREC細(xì)胞株增殖的影響。
　　5. HREC細(xì)胞鋪于含Matrigel的96孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為1μmol/ml CCR3-

8、antagonist干預(yù)組和PBS緩沖液對照組。在37℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察管腔形成情況。測定CCR3拮抗劑對HREC血管網(wǎng)形成的影響。
　　結(jié)果：
　　1.堿燒傷后CCR3、Eotaxin mRNA的表達(dá)有升高趨勢，提示CCR3-Eotaxin信號參與堿燒傷誘導(dǎo)的角膜新生血管的發(fā)生發(fā)展過程。
　　2.局部應(yīng)用CCR3-antagonist能抑制堿燒傷誘導(dǎo)的CRNV。
　　3. C