TNF-α在堿燒傷誘導(dǎo)角膜新生血管中的作用及機(jī)制.pdf

1、背景與目的:
　　 眼堿燒傷是臨床常見的眼外傷之一，是嚴(yán)重的致盲性眼病，堿燒傷后伴隨強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，常合并角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）的形成。CNV可導(dǎo)致患者視力下降、改變角膜的“免疫赦免”狀態(tài)，是角膜移植術(shù)后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的高危因素。其病理過程復(fù)雜，涉及諸多因素，確切的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明。CNV的治療方法較多，但目前的治療效果均不太理想，因此研究CNV發(fā)病機(jī)制和探討有效的治療

2、措施，將對(duì)防治CNV、防盲治盲都具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 TNF-α是一種主要由活化單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多能性細(xì)胞因子，可介導(dǎo)角膜炎和角膜潰瘍中的急性炎癥反應(yīng)及宿主防御機(jī)制，并且在角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程中起到關(guān)鍵性作用，同時(shí)與CNV形成之間也存在緊密聯(lián)系。但目前關(guān)于TNF-α在CNV形成過程中所起到的具體作用及內(nèi)在機(jī)制仍未完全闡明，亦未見外源性TNF-α對(duì)堿燒傷CNV形成影響的報(bào)道。本課題從建立小鼠堿燒傷CNV模型著手，觀察

3、重組鼠TNF-α對(duì)堿燒傷CNV的影響，利用免疫組織化學(xué)、RT-PCR和小鼠巨噬細(xì)胞特異剔除模型，探討TNF-α、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor.VEGF）三者之間在堿燒傷CNV形成中的作用與機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 1、15只BALB/c小鼠制作左眼堿燒傷誘導(dǎo)CNV模型，通過眼局部滴藥隨機(jī)分為100μg/ml TNF-α實(shí)驗(yàn)組、500μm/m

4、l、TNF-α實(shí)驗(yàn)組、0.2％透明質(zhì)酸鈉對(duì)照組，每組5只小鼠，自堿燒傷后分別給予100μg/ml、500μg/ml TNF-α或0.2％透明質(zhì)酸鈉點(diǎn)眼，每日2次，持續(xù)1w，堿燒傷后1d、7d、14d裂隙燈顯微鏡下觀察各組角膜的炎癥反應(yīng)、角膜穿孔及新生血管形成情況，于堿燒傷后14d處死所有小鼠，取眼球行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組角膜組織中CD31的表達(dá)，計(jì)數(shù)微血管密度，比較各組之間差異，分析 TNF-α對(duì)堿燒傷CNV形成的作用。
　　

5、 2、20只BALB/c小鼠堿燒傷后隨機(jī)分為100μg/ml TNF-α實(shí)驗(yàn)組、0.2％透明質(zhì)酸鈉對(duì)照組，每組10只小鼠，自堿燒傷后分別給予100μg/ml TNF-α或0.2％透明質(zhì)酸鈉點(diǎn)眼，每日2次，于傷后2d、4d兩組隨機(jī)取5只小鼠處死，取角膜行RT-PCR法檢測(cè)兩組 VEGF mRNA的表達(dá)情況，比較兩組之間的差異，分析 TNF-α對(duì)堿燒傷角膜中VEGF表達(dá)的影響。
　　 3、利用二氯亞甲基二磷酸脂質(zhì)體（Clodrona

6、te-liposomes，Cl2MDP-lip）腹腔注射制作小鼠巨噬細(xì)胞特異剔除模型，10只BALB/c小鼠隨機(jī)分為Cl2MDP-lip實(shí)驗(yàn)組及PBS-lip對(duì)照組，每組5只小鼠。所有小鼠自堿燒傷后均給予100μg/ml TNF-α滴眼，每日2次，持續(xù)1w，所有小鼠于堿燒傷后14d拍照記錄CNV形成情況，圖像分析軟件測(cè)量CNV長(zhǎng)度、計(jì)算CNV面積，比較兩組之間差異。分析巨噬細(xì)胞在TNF-α促進(jìn)堿燒傷CNV形成中的作用。
　　 結(jié)

7、果:
　　 1、堿燒傷后14d100μg/ml TNF-α實(shí)驗(yàn)組CNV形成較對(duì)照組明顯增多，同時(shí)免疫組化法檢測(cè)MVD較對(duì)照組明顯增多（p<0.05），而500μg/ml TNF-α實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間無明顯差異。表明低劑量 TNF-α能促進(jìn)堿燒傷CNV形成。
　　 2、堿燒傷后2d、4d100μg/ml TNF-α實(shí)驗(yàn)組小鼠角膜組織中 VEGF mRNA的表達(dá)水平均較對(duì)照組高（P<0.05）。表明 TNF-α能通過上調(diào)堿燒

8、傷角膜中VEGF的表達(dá)，促進(jìn)CNV的形成。
　　 3、Cl2MDP-lip實(shí)驗(yàn)組小鼠堿燒傷后14d CNV長(zhǎng)度、面積均較對(duì)照組明顯減少（p<0.05），表明巨噬細(xì)胞剔除可顯著降低 TNF-α對(duì)堿燒傷CNV形成的促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、低劑量重組鼠TNF-α具有促進(jìn)堿燒傷CNV形成的作用，而在高劑量時(shí)未表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)血管新生作用。
　　 2、低劑量TNF-α促進(jìn)堿燒傷CNV形成的作用機(jī)制可能與