GnRH拮抗劑Cetrorelix在子宮內(nèi)膜癌治療中作用機(jī)制研究.pdf

1、目的；本研究通過用不同濃度的GnRH拮抗劑cetrorelix作用于體外培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞株，觀察作用不同時(shí)間后癌細(xì)胞的生長抑制率和細(xì)胞周期、凋亡率的變化，探討cetrorelix對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、凋亡抑制機(jī)制。通過比較GnRH拮抗劑cetrorelix處理前后人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，從整體蛋白質(zhì)水平來揭示GnRH拮抗劑作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的分子機(jī)制，也為臨床上應(yīng)用GnRH拮抗劑治療子宮內(nèi)膜癌提供理

2、論依據(jù)。
　　 方法：1)聯(lián)合應(yīng)用組織芯片和免疫組化技術(shù)檢測不同分化程度不同臨床期別子宮內(nèi)膜癌組織中促性腺激素受體(GnRH-R)的表達(dá)；2)MTT法檢測不同濃度GnRH拮抗劑cetrorelix單用或與紫杉醇聯(lián)用對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞生長抑制率，確定cetrorelix對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖抑制的最佳濃度；流式細(xì)胞技術(shù)檢測作用后細(xì)胞周期與凋亡率變化；3)利用固相梯度雙向凝膠電泳技術(shù)建立藥物處理前后細(xì)胞總蛋白雙向凝膠電泳

3、圖譜，經(jīng)PDQuest軟件分析，選取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)肽質(zhì)量指紋圖譜，Mascot軟件搜索MSDB數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。4)采用Westernblot技術(shù)對部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：1)正常子宮內(nèi)膜組織GnRH-R蛋白全部表達(dá)為陽性，陽性表達(dá)率為100％(7/7)。子宮內(nèi)膜癌組織中GnRH-R蛋白陽性表達(dá)率為94％(59/63)，二者差異無顯著性(P>0.05)。

4、不同期別子宮內(nèi)膜癌組織中GnRH-R蛋白陽性表達(dá)率分別為Ⅰ期97％(55/57)，Ⅱ期80％(4/5)，Ⅲ期GnRH-R蛋白表達(dá)為陰性。不同分化程度子宮內(nèi)膜腺癌組織中GnRHR蛋白陽性表達(dá)率Ⅰ級94％(33/35)，Ⅱ級94％(17/18)，Ⅲ級為86％(7/8)。不同臨床期別和不同病理分級中子宮內(nèi)膜癌組織中GnRH-R蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2)GnRH拮抗劑對人子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞的增殖具有

5、抑制作用，GnRH拮抗劑cctrorelix抑制子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞生長呈時(shí)間和劑量依賴(P<0.05)，隨藥物濃度增加和作用時(shí)間延長，抑制作用越明顯。10-5mol/L Cetrorelix作用72h時(shí)達(dá)最大抑制率。聯(lián)合使用cetrorelix和紫杉醇對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞生長的抑制優(yōu)于二者單用。3)流式細(xì)胞儀檢測顯示10-5mol/L Cetrorelix作用72h可引起子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞的生長周期停

6、滯于S期，細(xì)胞凋亡率增加；4)經(jīng)雙向凝膠電泳和圖像分析，找出差異蛋白質(zhì)點(diǎn)53個(gè)(差異在2倍以上且在3組中均有相同的差異)，其中在處理組表達(dá)上調(diào)的12個(gè)，表達(dá)下調(diào)的33個(gè)，僅在處理組中表達(dá)的3個(gè)，僅在對照組中表達(dá)的5個(gè)。篩選31個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)作為差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，有21個(gè)蛋白得到鑒定，經(jīng)質(zhì)譜鑒定的蛋白包括7個(gè)處理后表達(dá)下調(diào)的蛋白即：α-烯醇化酶(ENO1)、熱休克蛋白90(HSP90)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDIA6)、抑制素(

7、Prohibitin-2)、絲裂原活化蛋白激酶(MAP2K2)、真核翻譯延伸因子1A2(EEF-1A2)、膜聯(lián)蛋白(annexinAl)。5)應(yīng)用Western Blot技術(shù)對Annexin Al和α-烯醇化酶進(jìn)行驗(yàn)證，Annexin Al和α-烯醇化酶在處理組中表達(dá)下調(diào)，與蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：GnRH受體可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起一定作用。GnRH拮抗劑cetrorelix能有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長